METODO RELACIONADO CON EL RECEPTOR DE QUIMIOCINAS 88C.

Método para identificar un ligando capaz de interactuar con el receptor de quimiocinas 88C,

que se caracteriza por la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:2, comprendiendo dicho método las etapas de:

(a) proporcionar una célula huésped que expresa dicho receptor, o una preparación de membrana que incluye dicho receptor,

(b) poner en contacto e incubar dicho receptor, con un ligando del mismo, y

(c) identificar la presencia de un ligando interactuado específicamente con dicho receptor

Método relacionado con el receptor de quimiocinas 88C.

La presente invención se refiere en general a vías de transducción de señales. Especialmente, la presente invención se refiere a receptores de quimiocinas, ácidos nucleicos que codifican receptores de quimiocinas, ligandos de receptores de quimiocinas, moduladores de la actividad del receptor de quimiocinas, anticuerpos que reconocen las quimiocinas y receptores de quimiocinas, métodos para identificar los moduladores y ligandos de receptores de quimiocinas, métodos para producir receptores de quimiocinas, así como métodos para producir anticuerpos que reconocen los receptores de quimiocinas.

Recientes avances en la biología molecular condujeron a una apreciación del papel central que desempeñan las vías de transducción de señales en los procesos biológicos. Estas vías comprenden un medio central por el cual las células individuales en un organismo multicelular se comunican, coordinando por este medio los procesos biológicos. Véase Springer, Cell 76:301-314 (1994), Tabla I como modelo. Una ramificación de las vías de transducción de señales, definida por la participación intracelular de proteínas de unión al nucleótido de guanina (proteínas-G), afecta a un amplio rango de procesos biológicos.

Lewin, GENES V319-348 (1994)exponen en general vías de transducción de señales a proteína G que implican, como mínimo, los siguientes componentes: una señal extracelular (por ejemplo, neurotransmisores, hormonas peptídicas, moléculas orgánicas, luz, u odorantes), receptor reconocedor de señales (receptor acoplado a proteína G, revisado en Probst y col., DNA and Cell Biology 11:1-20 [1992] y conocido también por GPR o GPCR), y una proteína intracelular, heterotrimérica de unión a GTP, o proteína G. En particular, estas vías son de gran interés debido a su papel en la regulación de glóbulos blancos o tráfico leucocitario.

Los leucocitos comprenden un grupo de tipos de células sanguíneas móviles que incluyen los granulocitos (es decir, neutrófilos, basófilos y eosinófilos), linfocitos y monocitos. Cuando se movilizan y activan, estas células están involucradas esencialmente en la defensa del cuerpo contra una materia extraña. Esta tarea es complicada por la diversidad de procesos normales y patológicos en los que participan los leucocitos. Por ejemplo, la función de los leucocitos en la respuesta inflamatoria normal a la infección. Los leucocitos también intervienen en varias inflamaciones patológicas. Como resumen, véase Schall y col., Curr. Opin. Immunol. 6:865-873 (1994). Además, cada uno de estos procesos puede involucrar contribuciones únicas, en grado, tipo y duración, de parte de cada uno de los tipos de células leucocitarias.

Al estudiar estas reacciones inmunes, los investigadores se concentraron inicialmente en las señales que actúan sobre los leucocitos, razonando que se pediría una señal para obtener cualquier forma de respuesta. Murphy, Ann. Rev. Immunol. 12:593-633 (1994) ha revisado los miembros de un grupo importante de señales leucocitarias, las señales peptídicas. Un tipo de señal peptídica comprende las quimiocinas (citocinas quimioatractivas) denominadas intercrinas en Oppenheim y col., Anni. Rev. Immunol. 9:617-648 (1991). Además de Oppenheim y col., Baggiolini y col., Advances in Immunol. 55:97-179 (1994), documentan el número creciente de quimiocinas que han sido identificadas y sometidas a análisis genéticos y bioquímicos.

Comparaciones de las secuencias de aminoácidos de las quimiocinas conocidas condujeron a un esquema de clasificación que divide las quimiocinas en dos grupos: el grupo a, caracterizado por un solo aminoácido que separa las dos primeras cisteinas (CXC; terminal N como referente) y el grupo ß, en el que estas cisteinas son adyacentes (CC). Véase Baggiolini y col., más arriba. Se han descubierto correlaciones entre las quimiocinas y los tipos particulares de células leucocitarias que responden a aquellas señales. Schall y col., tal como se menciona anteriormente, han reportado que la quimiocinas CXC afectan en general a los neutrófilos; las quimiocinas CC tienden a afectar a los monocitos, linfocitos, basófilos y eosinófilos. Por ejemplo, Baggiolini y col., mencionados más arriba, expusieron que RANTES, una quimiocina CC, funciona como quimioatractivo para los monocitos, linfocitos (es decir, células T de memoria), basófilos, y eosinófilos, pero no para los neutrófilos, aunque provoca la liberación de la histamina de los basófilos.

Cocchi y col., Science, 270: 1811-1815 (1995) demostraron recientemente que las quimiocinas son supresores de la proliferación del VIH. Cocchi y col., demostraron que RANTES, MIP-1a, y MIP-1ß suprimían el VIH-1, VIH-2 e infección por VIS de una línea celular CD4⁺ designada PM1 y de las células mononucleares primarias de sangre periférica humana.

Sin embargo, recientemente, la atención se ha vuelto hacia los receptores celulares que unen las quimiocinas, debido a que las quimiocinas extracelulares parecen contactar las células de forma indiscriminada, y por lo tanto carecen de la especificidad necesaria para regular los tipos individuales de células leucocitarias.

Murphy, tal como se menciona anteriormente, reportó que la superfamilia GPCR de receptores incluye la familia de receptores de quimiocinas. La estructura típica de receptores de quimiocinas incluye un dominio de unión de quimiocinas extracelulares localizado cerca del terminal N, seguido de siete regiones espaciadas de aminoácidos predominantemente hidrofóbicos capaces de formar hélices a transmembrana. Entre cada uno de los dominios a-helicoidales se encuentran dominios hidrofilicos localizados, de forma alterna, en los espacios intra o extra celulares. Estas características dan una conformación de serpentina al receptor de quimiocinas incrustado en la membrana. El tercer bucle intracelular interactúa típicamente con las proteínas G. Murphy, tal como se menciona anteriormente, notó que el terminal carboxilo intracelular es capaz también de interactuar con las proteínas G.

Los primeros receptores de quimiocinas que tuvieron que ser analizados por técnicas de clonación molecular fueron los dos receptores de neutrófilos para la IL8 humana, una quimiocina CXC. Holmes y col., Science 253:178-1280 (1991) y Murphy y col., Science 253:1280-1283 (1991), reportaron la clonación de estos dos receptores para la IL8. Lee y col., J. Biol. Chem. 267: 16283-16287 (1992), analizaron los ADNc que codifican estos receptores y encontraron un 77% de identidad de aminoácidos entre los receptores codificados, con cada receptor que mostraba características de la familia de receptores acoplados a proteína G. Uno de estos receptores es especifico de la IL-8, mientras que el otro se une y hace señales en respuesta a IL-8, gro/MGSA, y NAP-2. La manipulación genética de los genes que codifican los receptores de IL-8 ha contribuido a nuestra comprensión de los papeles biológicos desempeñados por estos receptores. Por ejemplo, Cacalano y col., Science 265:682-684 (1994) reportaron que la deleción del homólogo del receptor de IL-8 en el ratón resultaba en un fenotipo pleiotrópico que implicaba linfadenopatia y esplenomegalia. Además, un estudio sobre mutaciones de sentido erróneo descritas en Leong y col., J. Biol. Chem. 269:19343-19348 (1994) descubrió aminoácidos en el receptor de IL-8 que eran críticos para la unión de IL-8. Experimentos de intercambio de dominios expuestos en Murphy, tal como se menciona más arriba, implicaban el dominio extracelular amino terminal como un determinante de la especificidad de unión.

Varios receptores para las quimiocinas CC también han sido identificados y clonados. CCCKR1 se une tanto a MIP-1a como a RANTES y provoca el flujo de iones de calcio intracelular en respuesta a ambos ligandos. Charo y col., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 91:2752-2756 (1994) reportaron que otro receptor de quimiocina CC, el MCP-R1 (CCCKR2), es codificado por un único gen que produce dos variantes de empalme que difieren en sus dominios carboxilo terminal. Este receptor se une y responde a MCP-3 además de MCP-1.

Se ha identificado también un receptor promiscuo que se une a las quimiocinas tanto CXC como CC. Este receptor se identificó originalmente en células de glóbulos rojos y Horuk y col., Science 261:1182-1184 (1993) reporta que se une a IL-8, NAP-2, GROa, RANTES y MCP-1. El receptor de quimiocinas de los eritrocitos comparte aproximadamente el 25% de identidad con otros receptores de quimiocinas y puede ayudar a regular los niveles circulantes de quimiocinas o ayudar en la presentación de quimiocinas...

1. Método para identificar un ligando capaz de interactuar con el receptor de quimiocinas 88C, que se caracteriza por la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO:2, comprendiendo dicho método las etapas de:

2. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque dicho ligando está marcado.

3. Método según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque dicho ligando es un agonista o un antagonista.

4. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque dicha interacción se identifica mediante la medición de la concentración o nivel de actividad de un componente de una vía de transducción de señales.

5. Método según la reivindicación 4, caracterizado porque dicha vía de transducción de señales se identifica mediante la medición de una actividad seleccionada de entre el grupo compuesto de: concentración de calcio, hidrólisis de GTP y actividad de la fosfolipasa C.

6. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque dicho receptor se pone en contacto y se incuba con un ligando y otro compuesto de prueba.

7. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque dichas células son células HEK-293 o preparaciones de membrana de las mismas.