PROCEDIMIENTO Y DISPOSITIVO PARA MEDIR LA LUMINISCENCIA.

Procedimiento para la excitación y determinación de una luminiscencia en una muestra de analito (3) que está en contacto con el estrato conductor de ondas (8) de un conductor de ondas óptico estratificado,

y en el que se conduce al dispositivo de medición (12) y se determina la radiación luminiscente generada en el entorno próximo a la superficie del estrato conductor de ondas (8), después de penetrar en dicho estrato conductor de ondas, caracterizado porque se genera la luminiscencia mediante una excitación no evanescente en el volumen de la muestra de analito (3), generándose la excitación no evanescente mediante uno de los medios siguientes: (a) electrodos, mediante los cuales se excita una luminiscencia mediante la aplicación de un campo eléctrico, (b) una combinación de productos químicos que genera una quimiluminiscencia, y (c) radiación directa no evanescente mediante luz

Procedimiento y dispositivo para medir la luminiscencia.

La invención se refiere a un procedimiento para excitar y determinar una luminiscencia de un analito que se encuentra en contacto con la superficie del estrato conductor de ondas de una guía de ondas estratificada, en el que se genera de modo no evanescente una luminiscencia en el volumen del analito, que conduce la radiación luminiscente que ha penetrado desde la zona próxima en la superficie del estrato conductor de ondas al estrato conductor de ondas de la guía de ondas estratificada al sistema de medición óptico, preferentemente a través de por lo menos un elemento de desacoplamiento para la radiación luminiscente, y que después mide la luz luminiscente, por ejemplo por un método optoelectrónico. La invención se refiere también a un dispositivo de medida para llevar a cabo el procedimiento, y a una plataforma de sensores.

Para la identificación específica de un analito en una muestra que puede consistir en una mezcla compleja de sustancias y para ligar la molécula del analito a la superficie de la guía de ondas, inmovilizar en la zona de la profundidad de penetración del campo evanescente los elementos de identificación bioquímicos sobre la superficie de la guía de ondas, bien de forma directa o por medio de una capa de agente adherente. Para la determinación del analito se pone en contacto la muestra, bien en parada y flujo o en flujo continuo, con los elementos identificativos inmovilizados sobre la superficie de la guía de ondas.

Especialmente en el campo de la analítica bioquímica se han desarrollado muy recientemente guías de ondas planares para generar y detectar radiación de excitación evanescente. En el campo evanescente y en contacto con una muestra de analito se genera una luminiscencia, por ejemplo una fluorescencia, cuya medición permite efectuar una determinación cualitativa o cuantitativa de sustancias, incluso en una concentración muy baja. La radiación de excitación evanescente que sale al espacio de forma isótropa se determina por métodos optoelectrónicos mediante dispositivos de medida adecuados, tales como por ejemplo fotodiodos, fotomultiplicadores o cámaras CCD. Este método se da a conocer por ejemplo en el documento WO 95/33197. También existe la posibilidad de desacoplar y medir la parte de radiación de excitación evanescente vuelta a reacoplar en la guía de ondas por medio de un elemento difractor óptico. Este método se describe por ejemplo en el documento WO 95/33198. Se han conocido dispositivos (arrays) para realizar de modo simultáneo o consecutivo mediciones múltiples, donde en una plataforma de sensores están dispuestos como mínimo dos guías de ondas que se controlan de forma independiente con luz de excitación, véase por ejemplo el documento WO 96/35940.

El documento EP-A-0793090 describe una disposición de medida con un elemento de soporte transparente para la radiación de excitación y de medición, que en una primera capa límite presenta un elemento sensor óptico-luminiscente, que a través de una segunda capa límite absorbe radiación de excitación de una fuente de radiación y que a través de una tercera capa límite transmite la radiación de medición del elemento sensor a un detector de una unidad de evaluación.

Los métodos de medición conocidos plantean requisitos rigurosos a la precisión de posicionamiento de la luz de excitación en cuanto a los elementos de acoplamiento para lograr un acoplamiento de la luz suficiente y con ello suficiente sensibilidad. Por este motivo es imprescindible el empleo de componentes de ajuste, lo que complica la estructura técnica y se manifiesta especialmente en la construcción de arrays.

Además hay que limitarse al empleo de luz esencialmente coherente para ajustar el posicionamiento de acuerdo con las constantes de los elementos de acoplamiento y ajustar por ejemplo retículas difractivas.

Para las guías de ondas clásicas, altamente multimodales, tales como por ejemplo capilares multimodo, fibras de vidrio multimodo o plaquitas de vidrio multimodo se puede soslayar el problema de los rigurosos requisitos de posicionamiento para el acoplamiento de la luz de excitación mediante la aplicación del llamado "principio de concentración de lumniscencia", tal como esté descrito por ejemplo en Sensors and Actuators, tomo 38 a 39 (1997), pág. 96 a 102 y pág. 300 a 304. Ahora bien, aquí se emplean sin embargo guías de ondas ópticas, que se componen del sustrato propiamente dicho (sin un estrato de refracción superior adicional), que se encuentra en un entorno de un índice de refracción más bajo, y en los que debido a la forma geométrica resulta posible la reflexión total. Se describe que la luz luminiscente procedente de fuentes de emisión aplicadas sobre la superficie del sustrato tales como membranas de polímero que lleven incorporado un colorante indicador se concentran bajo un ángulo espacial grande, y a continuación se conducen en el sustrato de vidrio a un detector que se encuentra en la cara frontal de la guía de ondas. Típicamente se emplean tales colorantes indicadores en concentraciones elevadas, por ejemplo milimolares. Para medir concentraciones de determinación muy reducidas no son adecuados sustratos de vidrio tan gruesos empleados como guías de ondas multimodales.

Sorprendentemente se ha encontrado que también en el caso de guías de ondas estratificadas compuestas de un soporte transparente y un estrato conductor de ondas de alto poder de refracción se puede aplicar el principio del "colector de luminiscencia" y por lo tanto se evitan completamente los problemas unidos al acoplamiento de la luz de excitación, si se dirige la radiación de excitación sin empleo de elementos de acoplamiento, al menos parcialmente de modo directo sobre el volumen de la muestra de analito para generar la luminiscencia, por ejemplo en una disposición de luz incidente o de transmisión. La radiación luminiscente generada en la zona próxima a la superficie del estrato conductor de ondas se acopla sorprendentemente en el estrato conductor de ondas en una magnitud mensurable, y por ejemplo se puede determinar de modo optoelectrónico en la cara frontal de fibras ópticas o de guías de ondas planares o a través de elementos de desacoplamiento en el caso de guías de ondas planares. La luminiscencia generada en el volumen más lejano de analito prácticamente no se acopla sorprendentemente en el estrato conductor de ondas, por lo que se excluye la radiación luminiscente molesta generada en el analito, y resulta posible una medición casi exenta de fondo con alto nivel de selectividad espacial, alto rendimiento y alta sensibilidad.

Dentro del marco de la invención se entiende por guías de ondas estratificadas unas estructuras estratificadas a base de un sustrato transparente tal como por ejemplo vidrio, cuarzo o plásticos tales como policarbonato, con un índice de refracción menor que el estrato conductor de ondas de alta refracción aplicado sobre la superficie, con un índice de refracción de por ejemplo 1,8. El espesor del estrato conductor de ondas se elige preferentemente de tal modo que solamente puede conducir un único o solo unos pocos (por ejemplo hasta 3) modos discretos de luz de una determinada longitud de onda Las guías de ondas estratificadas se denominarán en lo sucesivo abreviadamente como guías de ondas.

También se ha hallado sorprendentemente que no solamente se puede medir con guías de ondas estratificadas una luminiscencia excitada por radiación óptica sino incluso luminiscencia generada por otros mecanismos, tales como por ejemplo quimio-luminiscencia, triboluminiscencia, bioluminiscencia o electroluminiscencia, y que de este modo se facilita un método nuevo para la determinación de alta sensibilidad de tal radiación luminiscente.

La irradiación directa de la muestra de analito que se encuentra en contacto con la superficie de la guía de ondas ofrece por ejemplo las siguientes ventajas:

1. Procedimiento para la excitación y determinación de una luminiscencia en una muestra de analito (3) que está en contacto con el estrato conductor de ondas (8) de un conductor de ondas óptico estratificado, y en el que se conduce al dispositivo de medición (12) y se determina la radiación luminiscente generada en el entorno próximo a la superficie del estrato conductor de ondas (8), después de penetrar en dicho estrato conductor de ondas, caracterizado porque se genera la luminiscencia mediante una excitación no evanescente en el volumen de la muestra de analito (3), generándose la excitación no evanescente mediante uno de los medios siguientes: (a) electrodos, mediante los cuales se excita una luminiscencia mediante la aplicación de un campo eléctrico, (b) una combinación de productos químicos que genera una quimiluminiscencia, y (c) radiación directa no evanescente mediante luz.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque la radiación luminiscente se genera mediante excitación eléctrica, química o radiación óptica.

3. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque como guía de ondas estratificada (3) se emplea una guía de ondas planar con elementos de desacoplamiento (4) para la luz luminiscente.

4. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado por emplearse una plataforma de sensores (1) que presenta una disposición unidimensional o bidimensional de por lo menos dos guías de ondas con elementos de desacoplamiento difractores (4).

5. Procedimiento según la reivindicación 4, caracterizado porque la plataforma de sensores está recubierta de un segundo estrato que en la zona de la luz luminiscente conducida contiene escotaduras para el alojamiento de una muestra de analito (3).

6. Procedimiento según la reivindicación 3, caracterizado porque la guía de ondas planar presenta uno o varios elementos para el desacoplamiento de la radiación luminiscente, y porque la muestra de analito (3) está dispuesta antes de uno o entre varios elementos de desacoplamiento (4).

7. Procedimiento según la reivindicación 2, caracterizado porque la radiación de excitación de la excitación de radiación óptica se dirige desde el lado opuesto del estrato conductor de ondas a través de una guía de ondas planar sobre una muestra de analito (3).

8. Dispositivo para la medición de luminiscencia generada por excitación en una muestra de analito (3), generándose la luminiscencia mediante la excitación no evanescente en el volumen de la muestra de analito (3), compuesto por