COLONIAS INDIVIDUALES DE CELULAS MIXOBACTERIANAS.

Un procedimiento para la producción de colonias individuales de la mixobacteria Sorangium que comprende cultivar la mixobacteria Sorangium sobre un medio nutriente que incluye de 1 g/l a 5 g/l de isoleucina y/o leucina

Colonias individuales de células mixobacterianas.

La presente invención se refiere a microorganismos mixobacterianos.

Los microorganismos mixobacterianos son bacterias del suelo ampliamente extendidas que incluyen, p. ej., la mixobacteria Sorangium, tal como la mixobacteria Sorangium cellulosum. De forma similar a los estreptomicetos, las bacterias mixobacterias pueden producir metabolitos secundarios con una alta diversidad estructural, p. ej. epotilonas, tales como epotilona A y epotilona B. Las bacterias mixobacterias tienen una característica excelente: son capaces de deslizarse.

Las células bacterianas pueden formar generalmente colonias individuales, p. ej. que pueden originarse a partir de una sola célula, si se cultivan sobre la superficie de un medio nutriente, p. ej., semisólido, p. ej. que contiene agar agar. Sin embargo, no pueden obtenerse colonias individuales, sino aglomerados de células bacterianas que se originan a partir de toda la superficie del medio nutriente, si se cultivan células mixobacterianas, debido a que las células mixobacterianas pueden ser capaces de moverse, p. ej. de deslizarse o de pulular sobre una superficie de un medio nutriente, p. ej., semisólido, p. ej. que contiene agar agar. Así, el cultivo de colonias individuales de células mixobacterianas, p. ej. que se originan a partir de una sola célula, puede ser difícil, p. ej. prácticamente imposible, si se cultiva una suspensión de células mixobacterianas sobre un medio nutriente, p. ej., semisólido.

Se ha encontrado ahora que, sorprendentemente, pueden obtenerse colonias individuales de células mixobacterianas sobre un medio nutriente, p. ej. semisólido, a pesar de la capacidad de las células mixobacterianas para moverse, p. ej. deslizarse o pulular, sobre una superficie de un medio nutriente, p. ej. semisólido.

En un aspecto, la presente invención proporciona una colonia individual de células mixobacterianas.

Una colonia individual, según se describe en la presente memoria, incluye, p. ej., una colonia celular que se origina a partir de una sola unidad formadora de colonias de células mixobacterianas, p. ej. en la forma de una colonia diferente con límites definidos, p. ej. que puede reconocerse a la vista como una colonia individual. El término "colonia individual", según se define en la presente memoria, significa una colonia que se origina a partir de un pequeño número, p. ej. menos de cuatro, de células mixobacterianas, preferiblemente a partir de una sola célula mixobacteriana.

Las mixobacterias incluyen preferiblemente la mixobacteria Sorangium, más preferiblemente la mixobacteria Sorangium cellulosum. Las células mixobacterianas incluyen preferiblemente células de la mixobacteria Sorangium, más preferiblemente células de la mixobacteria Sorangium cellulosum.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un procedimiento para la producción de colonias individuales de la mixobacteria Sorangium que comprende cultivar la mixobacteria Sorangium sobre un medio nutriente que contiene de 1 g/l a 5 g/l de isoleucina y/o leucina, p. ej. isoleucina; o isoleucina y leucina.

Un procedimiento de acuerdo con la presente invención puede llevarse a cabo como sigue:

Un medio nutriente apropiado incluye un medio nutriente sobre el que pueden crecer células mixobacterianas. Preferiblemente, el medio nutriente es semisólido, p. ej., el medio nutriente contiene agar agar. El medio nutriente para el crecimiento de mixobacterias es conocido como tal y la producción del mismo puede llevarse a cabo, p. ej., de acuerdo con un método como los convencionales. Típicamente, un medio nutriente para el crecimiento de células mixobacterianas puede contener

- una fuente de carbono asimilable, p. ej. glucosa;

- una fuente de nitrógeno asimilable, p. ej. NH₄⁺, p. ej. en la forma de (NH₄)₂SO₄, un digesto pancreatínico de caseína, tal como bactotriptona, p. ej. disponible comercialmente de Difco;

- una fuente de fósforo, p. ej. un fosfato, tal como KH₂PO₄;

- elementos traza, p. ej. Mg, p. ej. en la forma de MgSO₄, Ca, p. ej. en la forma de CaCl₂, Fe, tal como Fe-EDTA (EDTA: ácido etilendiaminotetraacético);

- opcionalmente una fuente de azufre, p. ej. un sulfato, tal como Na₂SO₄, (NH₄)₂SO₄;

opcionalmente compuestos tamponadores, p. ej. ácido (3-N-morfolino)propanosulfónico (MOPS).

El medio nutriente puede contener ingredientes adicionales y otros apropiados.

De acuerdo con la presente invención, el medio nutriente contiene isoleucina y/o leucina. Preferiblemente, el medio nutriente contiene isoleucina, o isoleucina y leucina. La isoleucina y la leucina incluyen L-isoleucina y L-leucina.

Se encontró que la isoleucina y/o leucina presente en el medio nutriente puede inhibir el deslizamiento o la pululación de células mixobacterianas sobre la superficie del medio nutriente.

La isoleucina y/o la leucina están presentes en el medio nutriente en una cantidad suficiente para inhibir el deslizamiento, p. ej. la pululación, de células mixobacterianas sobre el medio nutriente. Una cantidad apropiada de isoleucina y/o leucina en el medio nutriente incluye, p. ej., de 0,5 g a 10 g de isoleucina y/o leucina por litro de medio nutriente, tal como de 0,8 g/l a 6 g/l, p. ej. de 1 g/l a 5 g/l.

El medio nutriente que contiene isoleucina y/o leucina, p. ej. en forma semisólida, p. ej. que contiene agar agar, puede colocarse sobre un soporte, p. ej. una placa o un plato, para obtener un soporte con un medio nutriente, p. ej. semisólido, que contiene isoleucina y/o leucina sobre la superficie.

Un soporte con un medio nutriente, p. ej. semisólido, que contiene isoleucina y/o leucina sobre la superficie puede inocularse con una suspensión de células mixobacterianas.

Las células mixobacterianas pueden obtenerse de mixobacterias, incluyendo, p. ej., la mixobacteria Sorangium, tales como microorganismos de la mixobacteria Sorangium cellulosum que son bien conocidos, p. ej. están disponible comercialmente, p. ej. de acuerdo con un método como los convencionales.

Una suspensión de células mixobacterianas apropiadas, p. ej. un cultivo líquido de células mixobacterianas, puede obtenerse incubando un medio de cultivo líquido con células mixobacterianas. Un medio de cultivo líquido para la incubación de células mixobacterianas incluye un medio de cultivo sobre el que pueden crecer células mixobacterianas. Un medio de cultivo líquido apropiado es conocido o puede prepararse, p. ej., de acuerdo con un método como los convencionales. Un medio de cultivo líquido típico para incubar células mixobacterianas puede contener, p. ej., fuentes para carbono asimilable, nitrógeno asimilable etc., tales como glucosa, almidón, soja (harina), extracto de levadura; y elementos traza, p. ej. Mg, p. ej. en la forma de MgSO₄, Ca, p. ej. en la forma de CaCl₂, Fe, p. ej. en la forma de Fe-EDTA.

La incubación puede llevarse a cabo durante un tiempo apropiado, p. ej. varios días, a una temperatura apropiada, p. ej. de 20ºC a 40ºC, p. ej. alrededor de 30ºC, p. ej. bajo agitación. Las células mixobacterianas obtenidas pueden separarse por centrifugación y resuspenderse en medio de cultivo líquido reciente. La suspensión obtenida puede diluirse usando un medio de dilución apropiado, tal como un hidrolizado enzimático de polvo de habas de soja, p. ej. en forma diluida, p. ej. en solución del 1% al 10%, tal como solución al 5%, p. ej. diluido con agua, tal como una solución de Bacto Soytone, p. ej. disponible comercialmente de Difco. Puede ser apropiada una suspensión celular con un grado de dilución de hasta 10^-6, p. ej.

Puede obtenerse una suspensión diluida de células mixobacterianas que es apropiada para la inoculación de medio nutriente, p. ej. sobre un soporte.

Un soporte inoculado con un medio nutriente, p. ej. semisólido, que contiene isoleucina y/o leucina sobre la superficie puede incubarse, p. ej., de acuerdo con un método como los convencionales, p. ej.

- a temperaturas apropiadas, tales como de 30ºC a 40ºC, p. ej. 37ºC;

- durante un tiempo apropiado, p. ej. durante varios días, p. ej....

1. Un procedimiento para la producción de colonias individuales de la mixobacteria Sorangium que comprende cultivar la mixobacteria Sorangium sobre un medio nutriente que incluye de 1 g/l a 5 g/l de isoleucina y/o leucina.

2. Uso de un medio nutriente que incluye de 1 g/l a 5 g/l de isoleucina y/o leucina en un procedimiento para la mejora de cepas de la mixobacteria Sorangium.

3. A procedimiento para la producción de una cepa de la mixobacteria Sorangium que tiene una velocidad de producción de epotilona mejorada, que comprende las etapas

i) formar colonias individuales de células de la mixobacteria Sorangium pretratadas que tienen una velocidad de producción de epotilona mejorada en comparación con células de la mixobacteria Sorangium no tratadas sobre un medio nutriente que incluye de 1 g/l a 5 g/l de isoleucina y/o leucina, ii) seleccionar células de las colonias individuales obtenidas bajo la etapa i) que tienen una velocidad de producción de epotilona mejorada en comparación con células de la mixobacteria Sorangium no tratadas; iii) cultivar células seleccionadas en la etapa ii) que tienen una velocidad de producción de epotilona mejorada en comparación con células de la mixobacteria Sorangium no tratadas.

4. Un procedimiento para la producción de epotilona, que comprende las etapas

i) formar colonias individuales de células de la mixobacteria Sorangium pretratadas que tienen una velocidad de producción de epotilona mejorada en comparación con células de la mixobacteria Sorangium no tratadas sobre un medio nutriente que incluye de 1 g/l a 5 g/l de isoleucina y/o leucina, ii) seleccionar células de las colonias individuales obtenidas bajo la etapa i) que tienen una velocidad de producción de epotilona mejorada en comparación con células de la mixobacteria Sorangium no tratadas; iii) cultivar células seleccionadas en la etapa ii) que tienen una velocidad de producción de epotilona mejorada en comparación con células de la mixobacteria Sorangium no tratadas; iv) fermentar las células cultivadas obtenidas en la etapa iii); y v) aislar epotilona del caldo de fermentación.

5. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 4, en el que se produce epotilona B.

6. Un procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 3 a 5, el uso de acuerdo con la reivindicación 3 y una cepa de acuerdo con la reivindicación 6, en donde la mixobacteria es la mixobacteria Sorangium cellulosum.