Procedimiento para la detección de una isoforma relacionada con EET de la proteína priónica (PrPD) en una muestra de plasma de un mamífero que incluye un ser humano,

en el que dicha PrPD está presente como isoforma sensible a la proteasa o como isoforma resistente a la proteasa, consistiendo el procedimiento en:

a.tratamiento de la muestra de plasma con detergentes en concentraciones entre el 0,05 y el 1% para evitar la unión inespecífica de PrPC

b.puesta en contacto de la muestra de plasma con un anticuerpo de captura revestido en los pocillos de una placa de microfiltración o perlas y capaz de reconocer un epítopo conformacional en PrPD, siendo dicho epítopo específico para la isoforma relacionada con EET PrPD pero no necesariamente indicativo para la isoforma resistente a proteasa de la proteína priónica, y siendo dicho anticuerpo de captura el anticuerpo monoclonal 15B3 (DSM2298),

c.eliminación de las proteínas contaminantes por lavado y

d.detección de posibles complejos de PrPD-anticuerpos de captura

Procedimiento para la detección de enfermedades relacionadas con priones.

Campo de la invención

La presente invención se dirige a procedimientos para la detección de enfermedades priónicas en animales y seres humanos.

Antecedentes de la invención

Las encefalopatías espongiformes transmisibles (EET) o enfermedades priónicas son enfermedades neurodegenerativas letales en animales y en el hombre. El inicio de la dolencia clínica está precedido por un periodo de larga incubación de meses a décadas. Los síntomas clínicos de las EET incluyen demencia y pérdida de coordinación de movimientos. En los años 1980 se encontró que un signo común de las EET era la acumulación de una isoforma resistente a proteasa (PrP^res o PrP^Sc) anormal de la proteína priónica codificada por el hospedador (PrP^C) en anímales y seres humanos afectados. El descubrimiento de PrP^Sc proporcionó un marcador molecular que demostró ser específico para todas las enfermedades priónicas así como el principal, y muy probablemente el único, constituyente de la partícula infecciosa, denominada prión.

El núcleo resistente a la proteasa de PrP^Sc, designado como PrP27-30, fue descubierto analizando fracciones de proteinasa tratadas con K con una masa molecular aparente de 27 a 30 kDa de encéfalo de hámster sirio para infectividad por scrapie. La secuenciación N-terminal de PrP-27-30 condujo a la clonación del gen PrP codificado por el hospedador y a la identificación de la isoforma sensible a la proteasa de la proteína priónica (PrP^C) en animales no infectados. El evento patógeno clave en las EET es el cambio conformacional de la proteína priónica codificada por el hospedador (PrP^C) en la isoforma patológica denominada PrP^Sc (después de su primera identificación en roedores infectados experimentalmente con scrapie). Este cambio conformacional implica el repliegue de estructuras helicoidales a de PrP^C en hojas ß de PrP^Sc. Esta proteína priónica replegada, PrP^Sc, difiere de PrP^C sólo en su estructura terciaria y, así, tiene la misma secuencia de aminoácidos, así como las mismas modificaciones post-traslacionales como la glucosilación ligada a N y el anclaje GPI. La PrP^Sc se agrega en fibrillas amiloides y se acumula en tejido nervioso y en menor medida en tejidos linforreticulares.

En un hospedador infectado, los niveles de PrP^Sc son directamente proporcionales a las valoraciones de priones. Después de inoculación experimental de roedores con agentes de EET, PrP^Sc es detectable habitualmente en el sistema nervioso central semanas antes de la aparición de enfermedad, y su nivel aumenta hasta un máximo que se alcanza hasta meses antes de que el animal muera. Durante la fase asintomática, la infectividad y las PrP^Sc se detectan fácilmente en tejidos linforreticulares. Recientemente, se ha encontrado que PrP^Sc se acumula también en tejido muscular de hámsteres afectados oralmente con scrapie y en ratones transgénicos infectados experimentalmente.

Aunque el prototipo de todas las enfermedades priónicas, el scrapie en ovejas y cabras, se ha conocido desde hace más de dos siglos, una nueva forma de enfermedad priónica animal designada como encefalopatía espongiforme bovina (EEB) se ha desarrollado, desde su primer reconocimiento en el Reino Unido en 1986, como una zoonosis. La magnitud en que el ganado infectado por EEB ha entrado en la cadena alimentaria humana sigue siendo asunto de debate y ha sido objeto de una serie de estudios. Un estudio reciente publicado por el Colegio Imperial de Londres (Donnelly, C.A., Ferguson, N.M., Ghani, A.C. y Anderson, R.M., Statistical Methods in Medical Research 12, 177-190 (2003)) sugirió que basándose en nuevos datos epidemiológicos hasta 1,6 millones de reses infectadas por EEB podrían haber terminado en el plato de los consumidores británicos.

Las enfermedades priónicas humanas comprenden enfermedad de Creutzfeldt-Jakob (ECJ), enfermedad de Gerstmann-Straeussler-Scheinker (GSS), insomnio familiar fatal (IFF) y kuru. Estas enfermedades ilustran las tres manifestaciones de enfermedades priónicas en general, es decir, las formas esporádicas de la enfermedad (del 80 al 90% de todos los casos de ECJ), las formas heredades ligadas a mutaciones en el gen PrP humano (GSS familiar, ECJ familiar e IFF) y las formas infecciosas que se adquieren por trasplante, inyección o ingestión de productos derivados de tejidos contaminados con priones (ECJ yatrogénica, vECJ y kuru). Con la aparición de una nueva forma de enfermedad de Creutzfeldt-Jakob en el Reino Unido en 1996, se ha iniciado un nuevo episodio en la batalla contra enfermedades humanas causadas por patógenos transportados por el alimento. Hasta la fecha, se han comunicado 146 casos de variante de ECJ (vECJ) en el Reino Unido, y la evidencia científica convincente sostiene una relación causal entre EEB y vECJ. Sin que se hayan identificado factores de riesgo evidentes en estos pacientes, parece muy probable un vínculo causal con la exposición a productos alimenticios contaminados con EEB. La detección de vECJ antes de que los pacientes muestren síntomas clínicos es una prioridad urgente, ya que podría reducir espectacularmente el riesgo de contaminación de los suministros de sangre y el equipo hospitalario. Recientemente, un paciente en el Reino Unido desarrolló vECJ 6,5 años después de recibir una transfusión sanguínea de un donante que desarrolló síntomas de vECJ 3,5 años después de la donación de sangre (Llewelyn y col., 2004, The Lancet 363, 417-421). Esto suscitó la posibilidad de que la vECJ pudiera transmitirse por transfusión sanguínea y subraya la necesidad de una prueba de diagnóstico para detectar priones en sangre y fracciones de la misma. En la presente invención se desvela un procedimiento para detectar la forma asociada a la enfermedad de PrP en plasma de mamíferos infectados por EET.

Como PrP^Sc es el único marcador molecular fiable para enfermedades priónicas, la detección inmunológica en tejido encefálico de la parte resistente a la proteasa de PrP^Sc es la base de pruebas de diagnóstico rápidas que se usan en la actualidad para vigilancia activa de EEB y scrapie. Debido a la lenta cinética de acumulación de PrP^Sc en la fase preclínica de la enfermedad, las capacidades actuales de diagnóstico están fuertemente limitadas en lo que respecta a la detección de la enfermedad precozmente en el periodo de incubación. La invención desvelada en la presente memoria descriptiva proporciona procedimientos para la detección de enfermedades priónicas en la fase preclínica.

Aunque PrP^Sc se definió originalmente como una isoforma de PrP parcialmente resistente a la proteasa e insoluble en detergentes, se han identificado varias enfermedades priónicas que se asocian con PrP anormal que carece de la resistencia clásica a la proteasa. Las formas de PrP que se asocian con estas enfermedades priónicas se denominan PrP^Sc "sensibles a la proteasa" para distinguirlas de las formas de PrP^Sc resistentes a la proteasa.

Se piensa que la detección de la conformación relacionada con la enfermedad de la proteína priónica en tejidos de un animal o un ser humano human es un elemento de diagnóstico de enfermedad priónica. Para distinguir la PrP relacionada con la enfermedad de su precursor celular PrP^C, se requiere tratamiento con proteasas para destruir completamente la PrP^C, pero sólo eliminar una parte de PrP^Sc N-terminal sensible a la proteasa, o alternativamente puede usarse un anticuerpo que sea capaz de distinguir entre PrP^C y PrP^Sc. Se ha desvelado un anticuerpo semejante que ha demostrado que reacciona sólo con PrP^Sc nativa pero no con PrP^C en nuestra solicitud de patente WO-98/37.210 y en Korth y col, (1997, Nature 390: 74-77) con el titulo "Immunological detection of prions" que se incorpora en la presente memoria descriptiva como referencia para desvelar y describir dichos anticuerpos.

La mayoría de las pruebas que se usan en la actualidad para el diagnóstico de enfermedades priónicas se efectúan en tejido del sistema nervioso central que se obtiene post mortem de un animal o un ser humano que muestra enfermedad clínica o induce a sospecha de tener la enfermedad. Las pruebas de diagnóstico se basan en el uso de un pretratamiento para hidrolizar la forma sensible a la proteasa de la proteína priónica seguido por la detección de la forma resistente...

1. Procedimiento para la detección de una isoforma relacionada con EET de la proteína priónica (PrP^D) en una muestra de plasma de un mamífero que incluye un ser humano, en el que dicha PrP^D está presente como isoforma sensible a la proteasa o como isoforma resistente a la proteasa, consistiendo el procedimiento en:

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la muestra de plasma incluye PrP^D sólo como isoforma sensible a la proteasa.

3. Procedimiento según las reivindicaciones 1 ó 2, en el que el complejo anticuerpo/PrP^D se detecta directa o indirectamente mediante un ensayo inmunológico.