Inhibidores siRNA de la replicación del virus de la septicemia hemorrágica de la trucha (VHSV) y aplicaciones.

La invención se relaciona, en general, con secuencias denominadas siRNA (RNA silenciadores) derivados de los genes del virus de la septicemia hemorrágica de la trucha (VHSV), que codifican la polimerasa L con capacidad de inhibición de la replicación viral en células susceptibles de ser infectadas por VHSV. Dichos siRNA pueden ser utilizados, entre otras aplicaciones, en la elaboración de peces transgénicos resistentes genéticamente a la enfermedad causada por VHSV y en vacunas ADN en animales (peces) susceptibles de ser infectados por VHSV

Inhibidores siRNA de la replicación del virus de la septicemia hemorrágica de la trucha (VHSV) y aplicaciones.

Sector técnico de la invención

La invención se relaciona, en general, con secuencias denominadas siRNA (RNA silenciadores) derivados de los genes del virus de la septicemia hemorrágica de la trucha (VHSV), que codifican la polimerasa L con capacidad de inhibición de la replicación viral en células susceptibles de ser infectadas por VHSV. Dichos siRNA pueden ser utilizados, entre otras aplicaciones, en la elaboración de peces transgénicos resistentes genéticamente a la enfermedad causada por VHSV y en vacunas ADN en animales (peces) susceptibles de ser infectados por VHSV.

Antecedentes de la invención

Los rabdovirus son una de las mayores causas de mortalidad en los criaderos de peces, provocando grandes pérdidas en la industria de la cría de la trucha y el salmón. Entre los rabdovirus que afectan a peces (novirabdovirus), el virus de la septicemia hemorrágica (VHSV), originado en Europa pero recientemente extendido a América del Norte, es uno de los más peligrosos ya que no sólo afecta a salmónidos sino también al bacalao, rodaballos, corvinas (lubinas), anguilas, gallos y gambas. A pesar de los esfuerzos en este sentido, incluyendo vacunas ADN a nivel de laboratorio, no existe ninguna vacuna ni agente terapéutico comercial contra el VHSV.

El VHSV es un rabdovirus cuya partícula viral, de 170 x 80 MM aproximadamente, se compone de una nucleocápsida interior, que encierra una molécula de RNA monocatenario de polaridad negativa (ssRNA) con 11.000 bases y un peso molecular de 5-6,4 x 10⁶ kDa. Tiene una envoltura exterior en forma de bala, compuesta por una membrana lipoprotéica y por unas espículas triméricas de proteína que se proyectan hacia el exterior de ésta. El genoma completo de VHSV ha sido secuenciado (Meikc et al., 1999). Componen el virus las proteínas L, G, N. M1 y M2. La proteína L (190 kDa), asociada al RNA vírico, tiene actividad transcriptasa y replicasa. La proteína G o G (65 kDa) es una glicoproteína que forma las espículas triméricas, responsables de la producción de anticuerpos (Ac) neutralizantes. La nucleoproteína N (40 kDa) de la nucleocápsida es la proteína mayoritaria. En el VHSV se ha descrito además una proteína Nx relacionada antigénicamente con la proteína N, cuya función se desconoce. La fosfoproteína M1 o P (19 kDa) está asociada a la polimerasa L. La proteína M2 o M (25 kDa) puede estar situada alrededor de la membrana lipídica o en el interior de la nucleocápsida.

La infección causada por rabdovirus se inicia por la unión de éstos, a través de la proteína G, a receptores específicos en la membrana externa del huésped y continúa con una fusión de membranas dependiente de una bajada de pH después de que el virus haya sido introducido en el citoplasma de la célula por endocitosis. Una vez en el interior de las células, el rabdovirus se replica en el citoplasma merced a la polimerasa L, los viriones maduran y, finalmente, brotan por gemación en la superficie celular llegando a lisar la célula.

Debido a la importancia de la incidencia causada por las infecciones de rabdovirus sobre peces, en particular el VHSV, y a la escasez de vacunas o procedimientos terapéuticos comerciales disponibles, existe la necesidad de desarrollar tanto nuevas vacunas como métodos terapéuticos contra el VHSV y otros rabdovirus.

En los últimos años se ha descrito que los RNA de doble cadena de 19-25 nucleótidos o mer (siRNA por RNA silenciadores) inhiben la traducción de mensajeros que contengan secuencias complementarias a las suyas, contribuyendo a su destrucción a través de proteínas celulares. Parece ser que la cadena antisentido de los siRNA es la principal responsable de esta actividad. Este fenómeno está haciendo que la transfección de células con siRNA se esté convirtiendo en un método rutinario para el "knockdown" de la expresión génica específica en un rango muy amplio de organismos y líneas celulares.

Asimismo, cada vez son más los ejemplos de virus cuya replicación se puede inhibir con siRNA dirigidos contra los genes de sus proteínas, especialmente contra los de sus polimerasas [Ref. 1.- Barik, S., Control of nonsegmented negative-strand RNA virus replication by siRNA. Virus Research, 102:27-35 (2004)].

Entre los virus que se han podido inhibir con siRNA están el HIV-1 [Ref. 2.-Novina, C.D., et al., siRNA-directed inhibition of HIV-1 infection. Nature Medicine, 8: 681-686 (2002)], el virus respiratorio sincitial [Ref. 3.- Li, T., et al., siRNA targeting the Leader sequence of SARS-CoV inhibits virus replication. Gene Therapy, 12(9): 751-761 (2005)], el virus de la hepatitis [Ref. 4.- Baltayiannis,G., S.Filis, E. Tsianos and P. Karayiannis, Small interfering RNA(siRNA)-mediated inhibition of hepatitis C virus replication using bicistronic vector in vivo (cell line Huh-7) and in vitro. Journal of Hepatology , 2005. 42: 154-154], [Ref. 5.- Korf, M.,D. Jarczak, C.Beger, M.P. Manns, and M. Kruger, Inhibition of hepatitis C virus translation and subgenomic replication by siRNAs directed against highly conserved HCV sequence and cellular HCV cofactors, Journal of Hepatology, 2005, 43(2): 225-234)] y el rabdovirus de la estomatitis vesicular VSV de mamíferos [Ref. 1.- Barik, S., Control of nonsegmented negative-strand RNA virus replication by siRNA. Virus Research, 102:27-35 (2004)].

Los genes diana de los siRNA pueden tener un amplio rango de funcionalidades demostrando la versatilidad de la nueva técnica. A concentraciones nanomolares, los siRNA inhiben la síntesis de virus RNA negativos sin inducir respuestas de interferon ni inhibir la expresión de genes celulares. Como ejemplos de utilización de siRNAs con virus que atacan a los humano se podrían citar los documentos de patente US 2005/0191618 A1 para proteger contra el virus de inmunodeficiencia adquirida (HIV) y el US 2006/02 1 1 642 A1 contra el virus de la hepatitis C.

Los siRNA inhibidores de la replicación viral se pueden producir no solo por transfección de siRNA sintéticos sino también desde plásmidos bajo el control de promotores apropiados [Ref. 6.- Xia, X.G., H. Zhou, H. Ding, E. B. Affar, Y. Shi, and Z. Xu, An enhanced U6 promoter for synthesis of short hairpin RNA, Nucleic Acids Research, 2003. 31: e100-105]. Para paliar el efecto transitorio (24-72 h) de los siRNA transfectados, se han desarrollando plásmidos que además de codificar para el correspondiente siRNA (2 secuencias complementarias de 21 nucleótidos de ADN cada una separadas por 9 nucleótidos de bucle que al ser transcritas forman un RNA cuya estructura forma un RNA de doble cadena unidas por un extremo con el bucle que se denomina "hairpin") tiene genes de resistencia a la puromicina con los que se pueden generar líneas celulares permanentemente produciendo siRNA por lo que resultan inhibir los genes diana elegidos (pSilencer, Clontech-Ambion y/o pRNA-CMV3.1, GenScript).

Los autores de la presente solicitud han ensayado varios siRNA sintéticos a partir de la secuencia de la polimerasa L de VHSV 07.71 por su capacidad de inhibir la replicación de VHSV en la línea celular modelo EPC (Ephitelioma papulosum cyprini) definida en la Decisión de la Comisión Europea 2001/183/CE. Se han encontrado varios siRNA inhibidores, y se han clonado los correspondientes siRNA en plásmidos pSilencer y/o pRNA-CMV3.1 comprobándose su actividad en líneas celulares EPC permanentemente refractarias a la infección de VHSV. Se abre así la posibilidad de poder modificar peces genéticamente para expresar permanentemente uno o varios siRNA contra VHSV y/o potenciar vacunas ADN incluyendo en la formulación plásmidos que codifiquen siRNA específicos para VHSV.

El estado de la técnica más pertinente se centra en invenciones que utilizan siRNAs de aproximadamente 20 nucleótidos que puedan actuar con actividad antiviral y más específicamente frente al virus de la septicemia hemorrágica de la trucha (VHSV).

La solicitud de patente WO 2004/085645 A1 se refiere a un método profiláctico o terapéutico de enfermedades infecciosas virales en animales de piscifactorías tales como las gambas, mediante la tecnología de RNA silenciador (siRNA).

Dicho documento proporciona el uso de RNA de doble cadena (incluyendo siRNAs de 21-23 pares de bases) o de un vector de expresión capaz de dirigir la transcripción de RNA de doble cadena en la elaboración de un medicamento para el tratamiento o prevención de enfermedades infecciosas en peces. Estas secuencias de RNA...

1. Un siRNA del virus de la septicemia hemorrágica (VHSV) caracterizado porque dicho siRNA codifica una secuencia de entre 19 y 23 nucleotidos de la proteina L de VHSV entre el nucleótido 38 y 56 o 53 y 73 o 250 y 270, en donde dicho siRNA tiene la capacidad de inhibir la infección de VHSV en células susceptibles de ser infectadas por el VHSV.

2. Un siRNA del virus de la septicemia hemorrágica (VHSV) de acuerdo con la reivindicación 1 caracterizado porque dicho siRNA codifica una secuencia de entre 19 y 23 nucleótidos de la proteína L de VHSV entre el nucleótido 53 y 73.

3. Un siRNA del virus de la septicemia hemorrágica (VHSV) de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizado porque presenta la secuencia SEQ. ID. No 6 que codifica la secuencia de la proteína L de VHSV entre el nucleótido 53 y 73, en donde dicho siRNA se denomina o104.

4. Un siRNA del virus de la septicemia hemorrágica (VHSV) de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque dicho siRNA codifica una secuencia de entre 19 y 23 nucleótidos de la proteína L de VHSV entre el nucleótido 38 y 56.

5. Un siRNA del virus de la septicemia hemorrágica (VHSV) de acuerdo con la reivindicación 4, caracterizado porque presenta la secuencia SEQ. ID. No 7 que codifica la secuencia completa de la proteína L de VHSV entre el nucleótido 38 y 56, en donde dicho siRNA se denomina o105.

6. Un siRNA del virus de la septicemia hemorrágica (VHSV) de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque dicho siRNA codifica una secuencia de entre 19 y 23 nucleótidos de la proteína L de VHSV entre el nucleótido 250 y 270.

7. Un siRNA del virus de la septicemia hemorrágica (VHSV) de acuerdo con la reivindicación 6, caracterizado porque presenta la secuencia SEQ. ID. No 8 que codifica la secuencia completa de la proteína L de VHSV entre el nucleótido 250 y 270, en donde dicho siRNA se denomina o106.

8. Un vector que comprende las secuencias correspondientes a la codificación de un siRNA según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

9. Vector según la reivindicación 8, seleccionado entre un plásmido de ADN y un vector de expresión capaz de ser expresado en células eucariotas.

10. Vector según la reivindicación 8 ó 9, que comprende, además, los elementos necesarios para la expresión y traducción de dicho siRNA y/o elementos reguladores para su transcripción y/o traducción.

11. Utilización de un siRNA del virus de la septicemia hemorrágica (VHSV) que codifica una secuencia de la proteína L de VHSV de acuerdo con las reivindicación 1 a 7, para inhibir la infección de VHSV en células susceptibles de ser infectadas por el VHSV.

12. Utilización de un siRNA del virus de la septicemia hemorrágica (VHSV) que codifica una secuencia de la proteína L de VHSV de acuerdo con la reivindicación 11, caracterizado porque dicho oligo es o104.

13. Utilización de un siRNA del virus de la septicemia hemorrágica (VHSV) que codifica una secuencia de la proteína L de VHSV de acuerdo con la reivindicación 11 caracterizado porque dicho oligo es o105.

14. Utilización de un siRNA del virus de la septicemia hemorrágica (VHSV) que codifica una secuencia de la proteína L de VHSV de acuerdo con la reivindicación 11 caracterizado porque dicho oligo es o106.

15. Utilización de una mezcla de dos de los tres oligos a elegir entre o104 y/o o105 y/o o106 definidos según reivindicaciones 3, 5 y 7, para inhibir la infección de VHSV en células susceptibles de ser infectadas por el VHSV.

16. Utilización de una mezcla de los tres oligos o104, o105 y o106 definidos según reivindicaciones 3, 5 y 7, para inhibir la infección de VHSV en células susceptibles de ser infectadas por el VHSV.

17. Utilización de un vector de acuerdo con las reivindicaciones 8-10, para inhibir la infección de VHSV en células susceptibles de ser infectadas por el VHSV.