Fracción antigénica de Ascaridia galli, anticuerpos específicos frente a la misma y métodos de detección del patógeno.

La presente invención se refiere a una fracción antigénica específica del parasito Ascaridia galli de entre 20 y 60 KDa, anticuerpos específicos frente a dicha fracción, así como a métodos que permitan la identificación del parásito en estadíos tempranos de la infección

Fracción antigénica de Ascaridia galli, anticuerpos específicos frente a la misma y métodos de detección del patógeno.

La presente invención se refiere a una fracción antigénica específica del parásito Ascaridia galli de entre 20 y 60 KDa, anticuerpos específicos frente a dicha fracción, así como a métodos que permitan la identificación del parásito en estadios tempranos de la infección.

Estado de la técnica anterior

Ascaridia galli es un nematodo intestinal que infecta tanto a las aves silvestres como a las domésticas, todas ellas pertenecientes al orden de las gallináceas, y resultando especialmente problemática en las explotaciones de gallinas (Gallus gallus) y pavos (Meleagris gallopavo). Los hospedadores resultan infectados por ingestión de huevos embrionados del parásito (con las larvas de segundo estadio, L2) depositados en el suelo con las heces de aves infectadas. Por esta razón, la adopción de un tipo "tradicional" de cría en el suelo, o similares (sistemas orgánicos o de cama de paja), implica un riesgo importante de diseminación en las granjas comerciales, en las que las aves suelen encontrarse hacinadas. Diversos estudios han demostrado prevalencias elevadas de A. galli en aves de corral de diversas partes del mundo. Un diagnóstico precoz eficaz, capaz de detectar el parásito antes de que sus huevos aparezcan en las heces de las aves parasitadas, es la herramienta primaria para ejercer un control adecuado sobre los parásitos.

Aunque hay estudios previos que han permitido la detección de la presencia A. galli en sangre de gallinas infectadas naturalmente, mediante las técnicas de ELISA y Western blot (Martín-Pacho et al., (2005) J. Vet. Med. Series B, 52: 238-242), dicha detección se produce en estadíos ya muy avanzados de la enfermedad cuando ésta ya es crónica, no posibilitando atajar la diseminación del nematodo. Persiste por tanto la necesidad avanzar en el diagnóstico temprano de la enfermedad antes de que los animales comiencen a eliminar los huevos del parásito a través de las heces y el nematodo se propague.

Breve descripción de la invención

Las investigaciones realizadas se han enfocado a avanzar en el diagnóstico de esta enfermedad poniendo a punto un método de ELISA capaz de detectar tempranamente al parásito, tanto en suero como en yema de huevo, con el objetivo de identificar las aves parasitadas antes de que A. galli comience a eliminar sus huevos con las heces de las gallináceas parasitadas y se extienda a toda la explotación. De este modo, los autores de la presente invención han descubierto, sorprendentemente, una serie de fracciones antigénicas que contribuye han permitido desarrollar métodos que posibilitan la detección temprana de A. galli en aves, preferentemente del Orden de las Gallináceas.

Así un primer aspecto de la presente invención se refiere a una fracción antigénica de 20 a 60 KDa o fragmentos de la misma obtenibles a partir de una muestra biológica, perteneciente a una especie del Orden de las Gallináceas e infectada por Ascaridia galli, por un método que comprende los siguientes pasos: a) someter la muestra a medios que permitan la separación de sus diferentes fracciones antigénicas en función de su peso molecular. Esta separación puede realizarse por técnicas que comprenden sin ningún tipo de limitación: electroforesis, cromatografía de presión alta o media presión, etc., b) aislar la fracción comprendida entre los 20 y 60 kDa o fragmentos de la misma.

En una realización preferida de este aspecto de la invención la muestra biológica pertenece a cualquiera de las especies Gallus gallus o Meleagris gallopavo. En una realización todavía más preferida los fragmentos de la fracción antigénica de 20 a 60 KDa son seleccionados de cualquiera de los siguientes: i) 29-34 KDa, ii) 43-54 KDa, ó iii) 56-65 KDa. Y más preferentemente de los siguientes: 48-50 KDa ó 45 KDa. En adelante la fracción antigénica de 20 a 60 KDa y los fragmentos de ésta serán denominados como "fracción antigénica y fragmentos antigénicos de la invención".

Un segundo aspecto de la invención se refiere a anticuerpos o fragmentos de los mismos capaces de interaccionar con la fracción antigénica o fragmentos antigénicos de la invención. En adelante estos anticuerpos serán denominados como "anticuerpos de la invención".

Un tercer aspecto de la invención está referido a un método in vitro para la detección temprana de Ascaridia galli en una muestra biológica de una especie perteneciente al orden de las gallináceas, preferentemente a Gallus gallus o Meleagris gallopavo, potencialmente infectada que comprende: a) poner en contacto la muestra aislada con la fracción antigénica o fragmentos antigénicos de la invención, b) detectar la interacción de los anticuerpos contenidos en la muestra con la fracción antigénica o fragmentos de la misma del paso a), donde la detección positiva de la interacción es indicativa de la presencia de Ascaridia galli en la muestra. En una realización preferida de este aspecto de la invención la detección temprana de Ascaridia galli es llevada a cabo mediante un anticuerpo secundario marcado y capaz de interaccionar con los anticuerpos fijados a la fracción antigénica o fragmentos de la misma.

Un cuarto aspecto de la invención se refiere a un método in vitro para la detección temprana de Ascaridia galli en una muestra biológica de una especie perteneciente al orden de las gallináceas, preferentemente a Gallus gallus o Meleagris gallopavo, potencialmente infectada que comprende: a) poner en contacto una muestra aislada con los anticuerpos de la invención, b) detectar la interacción de los anticuerpos con la fracción antigénica o fragmentos de la invención, donde la detección positiva de la interacción es indicativa de la presencia de Ascaridia galli en la muestra.

En una realización todavía más preferida de este aspecto de la invención la muestra potencialmente infectada procede, sin ningún tipo de limitación, de huevo, sangre, suero, ó heces.

Un quinto aspecto de la invención se relaciona con un kit de detección para la detección temprana de Ascaridia galli en una muestra biológica de una especie perteneciente al orden de las gallináceas, preferentemente a Gallus gallus o Meleagris gallopavo, potencialmente infectada que comprende: a) la fracción antigénica o fragmentos de la invención y/o b) los anticuerpos de la invención.

Un sexto aspecto de la invención se refiere al uso de la fracción antigénica o fragmentos antigénicos de la invención para la obtención de anticuerpos que permiten la detección temprana de Ascaridia galli.

Definiciones

Anticuerpo: a lo largo de la descripción, este término hará referencia tanto a anticuerpos monoclonales como policlonales.

Fragmentos de anticuerpos: a lo largo de la descripción, este término hará referencia a todos aquellos fragmentos de anticuerpos capaces interaccionar frente a la región antigénica de la invención o fragmentos de la misma, comprendiendo las además dichos fragmentos de anticuerpos a las regiones variables Vh y/o VI de los anticuerpos.

Kit de detección: a lo largo de la descripción se entenderá por kit de análisis o detección cualquier tipo de soporte o recipiente que permita llevar a cabo el método de la invención. Este kit puede comprender, sin ningún tipo de limitación, todos aquellos reactivos, tampones, etc. que permitan la puesta a punto del mismo.

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplos y dibujos se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.

Breve descripción de las Figuras

Figura 1.- Respuesta de anticuerpos IgG contra el complejo antigénico de adultos de A. galli en gallinas infectadas experimentalmente, medidas mediante ELISA. 1A. Respuesta en suero. 1B. Respuesta en yema de huevo.

Figura 2.- Identificación mediante Western blot de moléculas implicadas en la respuesta temprana contra el complejo...

1. Fracción antigénica de 20 a 60 KDa o fragmentos de la misma perteneciente a una especie del orden Gallináceas infectada por Ascaridia galli.

2. Fracción antigénica de 20 a 60 KDa o fragmentos de la misma según la reivindicación anterior, donde los fragmentos son seleccionados del grupo que comprende:

3. Fracción antigénica de 20 a 60 KDa o fragmentos de la misma según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, donde al menos uno de los fragmentos es seleccionado de entre los 48-50 KDa.

4. Fracción antigénica de 20 a 60 KDa o fragmentos de la misma según la reivindicación 1, donde al menos uno de los fragmentos es esencialmente de 45 KDa.

5. Fracción antigénica o fragmentos de la misma según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde la especie del orden Gallináceas es seleccionada del grupo que comprende

6. Anticuerpos o fragmentos de los mismos capaces de interaccionar con la fracción antigénica o fragmentos de la misma, según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

7. Método in vitro para la detección temprana de Ascaridia galli en una muestra biológica, perteneciente a una especie del orden Gallináceas, que comprende los siguientes pasos:

donde la detección positiva de la interacción es indicativa de la presencia de Ascaridia galli en la muestra.

8. Método in vitro para la detección temprana de Ascaridia galli, según la reivindicación anterior, donde la detección de la interacción es llevada a cabo mediante un anticuerpo secundario marcado.

9. Método in vitro para la detección temprana de Ascaridia galli en una muestra biológica, perteneciente a una especie del orden Gallináceas, que comprende:

donde la detección positiva de la interacción es indicativa de la presencia de Ascaridia galli en la muestra.

10. Método in vitro según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9 donde la especie del orden Gallináceas es seleccionada del grupo que comprende

11. Método in vitro para la detección temprana de Ascaridia galli, según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, donde la muestra biológica procede de huevo.

12. Método in vitro para la detección temprana de Ascaridia galli, según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10, donde la muestra biológica es seleccionada del grupo que comprende:

13. Kit de detección para la detección temprana de Ascaridia galli en una muestra biológica, perteneciente a una especie del orden Gallináceas, que comprende:

14. Kit de detección, según la reivindicación anterior, donde la especie del orden Gallináceas es seleccionada del grupo que comprende:

15. Uso de la fracción antigénica de 20 a 60 KDa o fragmentos de la misma, según cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 5, para la obtención de anticuerpos específicos frente a Ascaridia galli.