Utilización de hepatocitos humanos para la determinación in-vitro de la función hepática en un probando,

en la que se realiza una medición del daño de las células de los hepatocitos humanos después de la incubación con plasma de probandos

La presente invención se refiere a la utilización de hepatocitos humanos para la determinación in-vitro de la función hepática y para la regeneración del hígado en un probando, en particular en un paciente, así como a la utilización de estos hepatocitos humanos como parámetros de fosgeno. Además, la presente invención se refiere a un procedimiento in-vitro para la determinación de la función hepática y la regeneración del hígado en un probando, en particular, en un paciente, utilizando hepatocitos humanos.

Estado de la técnica

Los formadores de enfermedades “Systemic Inflammatory Response Syndrom” (SIRS) con fallos de órganos múltiples, sepsis grave y choque séptico están con frecuencia en relación con el desarrollo de un daño reversible del hígado, con lo que se puede producir una limitación de las funciones hepáticas. Una administración regular de medicamentos, un alto consumo de alcohol o también infecciones pueden perjudicar igualmente en una medida considerable la función del hígado. Los formadores de enfermedades mencionados anteriormente pueden conducir en raros casos a un fallo irreversible del hígado.

Una función hepática limitada o bien perturbada puede tener como consecuencia, por ejemplo, una perturbación de la función del cerebro, como la encefalopatía hepática. Ésta es provocada por la metabolización reducida de productos de productos de proteolisis en el hígado. Una función renal limitada se manifiesta de forma sintomática, por ejemplo, a través de una reducida capacidad de rendimiento, fatiga, somnolencia y en raras ocasiones también una sensación de presión en la región epigástrica.

En el choque séptico, aproximadamente el 22 % de todos los pacientes desarrollan, por último, un fallo hepático (1). Como fallo hepático o insuficiente hepática se designa la extinción de la función hepática hasta el coma hepático. El fallo hepático se caracteriza por la aparición de ictericia (Ikterus), encefalopatía hepática, síndrome hepato-renal, trastornos de la coagulación de la sangre, hipalbuminosis con ascitis, trombocitopenia o trastornos endocrinos.

Harbrecht y colaboradores pudieron verificar en un estudio que un fallo del hígado, que se desarrolla en el transcurso de una estancia en un hospital, prolonga el tiempo de residencia en el hospital y eleva en una medida considerable la mortalidad (2). Los motivos de ellos no están todavía aclarados en detalle. Los modelos de enfermedad conocidos hasta ahora parten de un daño del hígado, que procede de una limitación de la perfusión del esplácnico, de una disfunción del endotelio y de un daño directo a través de toxinas bacterianas u otras, como por ejemplo toxinas endógenas (3-6).

Por último, hay que indicar que en el caso de fallo agudo del hígado, que no se produce en el marco de SIRS o sepsis, se pueden constatar marcadores de inflamación humorales y celulares intensificados (7).

La sepsis los SIRS con fallo de órganos múltiples y los fallos hepáticos están en todo el mundo en la punta de las causas de muerte. En los USA enferman cada año aproximadamente 500.000 pacientes de sepsis con una mortalidad media del 21 % (8). En Alemania, mueren cada año 70.000 pacientes de esta enfermedad y sus complicaciones. Aproximadamente 20.000 pacientes al año mueren en Alemania de una enfermedad hepática. Cuando se produce un fallo hepático fulminante, solamente queda en último término un transplante de hígado.

En general, se puede constatar que la determinación o bien el diagnóstico de una función hepática limitada o bien perturbada en un probando en el instante más temprano posible tiene la máxima importancia, puesto que de esta manera se puede tratar precozmente de manera correspondiente un fallo agudo de hígado o se puede prevenir precozmente.

Una función hepática limitada o bien trastornada se puede diagnosticar actualmente a través de la medición de diferentes valore sanguíneos específicos y no específicos del hígado. Así, por ejemplo, a través de la medición de las enzimas del hígado glutamal-piruvat-transaminasas (GPT), glutamat-oxalacetat-transaminasas (GOT) y gamma^glutamil-transferasas gamma-GT) se puede determinar un daño hepático. Un trastorno de la función excretora y de la función de desinfección del hígado tiene como consecuencia, por ejemplo, altos valore de bilirrubina, gamma-GT, amoníaco y fosfatasa alcalina (AP). En el caso de una capacidad limitada de síntesis del hígado se puede reducir también el contenido de proteínas en el plasma, como por ejemplo la albúmina y muchos factores de la coagulación.

Los procedimientos diagnósticos utilizados actualmente tienen, sin embargo, el inconveniente de que muchos de loa valores sanguíneos mencionados solamente en el caso de fallo progresivo del hígado están claramente en la zona patológica y, por lo tanto, son inadecuados para la detección precoz de un fallo del hígado.

Para la determinación de la función hepática se utiliza, además, procedimientos que calculan, por ejemplo, la perfusión del esplácnico. Esto se realiza, por ejemplo, con el sistema LIMON (PULSION Medical Systems AG. Alemania).

El sistema LIMON para la determinación de la perfusión del esplácnico y de la función hepática se encuentra actualmente en prueba clínica (3-4). Pero en este procedimiento, por razones técnicas, especialmente en pacientes con sepsis altas, es muy difícil realizar una medición correcta con este sistema.

En resumen, se puede decir, que los procedimientos habituales empleados actualmente solamente proporcionan manifestaciones relativamente inespecíficas con respecto a la función hepática en un paciente.

Se conocen a partir de la patente US 5.290.684 A hepatocitos humanos de una línea de células HepG2/C3A, quesolamente se pueden utilizar aquí terapéuticamente. Éstos se pueden adquirir en el comercio.

Representación de la invención

El cometido de la invención es, por lo tanto, preparar un nuevo ensayo de citotoxicidad sobre la base de hepatocitos humanos, que detecta el daño directo del hígado y su regeneración en un probando.

De acuerdo con la invención, para la solución de este cometido se prepara un procedimiento in-vitro nuevo utilizando hepatocitos humanos y una utilización nueva de hepatocitos humanos, respectivamente, de manera que se puede determinar la función hepática de un probando, en particular en un paciente, tiene está enfermo de Systemic Inflammatory Response Syndrom” (SIRS), sepsis, fallo del hígado o fallo de órganos múltiples en el plano celular.

Hasta ahora no se conocen ensayos comparativos en el plano celular para la determinación de la función hepática en probandos, en particular en un paciente con función hepática limitada o bien trastornada, como se prepara con el procedimiento in-vitro de acuerdo con la invención. En particular, no se conoce un ensayo de citotoxicidad sobre la base de hepatocitos humanos, que detecte el daño directo del hígado en un paciente con los formadores de enfermedad SIRS con fallo de múltiples órganos, sepsis grave, choque séptico y fallo del hígado en el plano celular.

El procedimiento in-vitro de acuerdo con la invención o bien la utilización de acuerdo con la invención de hepatocitos humanos para la determinación in-vitro de la función hepática en el plano celular tiene la ventaja de que se pueden encontrar manifestaciones sobre la función hepática de un probando, en particular de un paciente, de maneras esencialmente más exacta y más precoz en comparación con los procedimientos disponibles actualmente.

Hay que indicar que el concepto “probando” comprende a continuación tanto un “probando sano” como también un “probando enfermo” en el sentido de un paciente.

El procedimiento in-vitro de acuerdo con la invención o bien la utilización de acuerdo con la invención de hepatocitos humanos para la determinación in-vitro de la función hepática se base en el principio de que cualquier sustancia, en función de su concentración y combinación con otras sustancias, puede tener influencias tóxicas sobre células humanas. Con el procedimiento o bien con la utilización de acuerdo con la invención se prepara de esta manera un ensayo de citotoxicidad, en el que se detecta la citotoxicidad endógena y exógena (provocada, por ejemplo, por medicamentos).

De acuerdo con la invención, para la... [Seguir leyendo]

1. Utilización de hepatocitos humanos para la determinación in-vitro de la función hepática en un probando, en la que se realiza una medición del daño de las células de los hepatocitos humanos después de la incubación con plasma de probandos.

2. Utilización de acuerdo con la reivindicación 1, en la que los hepatocitos humanos son seleccionados a partir de las líneas de células hepáticas humanas C3A, HLE, HepG2, HuH7, Hep3B, PLC/PRF/5 que se pueden adquirir en el comercio.

3. Utilización de acuerdo con la reivindicación 1, en la que los hepatocitos humanos son células HepG2/C3A.

4. Utilización de acuerdo con las reivindicaciones 1, 2 ó 3, para la detección precoz de un fallo hepático, para la supervisión de terapias, del desarrollo del tratamiento y de la regeneración de la función hepática y como parámetros de pronóstico.

5. Utilización de acuerdo con la reivindicación 4, en la que el probando está enfermo de “Systemic Inflammatory Response Syndrom” (SIRS), sepsis, sepsis grave, choque séptico, fallo del hígado o fallo de múltiples órganos.

6. Procedimiento in-vitro para la determinación de la función hepática en un probando utilizando hepatocitos humanos, en el que después de la incubación de los hepatocitos humanos, que se pueden adquirir en el comercio, con plasma de probando, se deriva la función hepática del probando por medio de medición de los parámetros vitalidad, funcionalidad y grado de activación de los hepatocitos humanos y los hepatocitos humanos están seleccionados a partir de las líneas de células hepáticas humanas C3A, HLE, HepG2, HepG2/C3A, HuH7, Hep3B, PLC/PRF/5.

7. Procedimiento in-vitro de acuerdo con la reivindicación 6, en el que los hepatocitos humanos son células HepG2/C3A.

8. Procedimiento in-vitro de acuerdo con una de las reivindicaciones 6 ó 7, en el que la función hepática del probando se deriva por medio de medición de la actividad de Cytochrom P450 Isoenzym 1A2 (CYP 1A2) de los hepatocitos humanos.

9. Procedimiento in-vitro de acuerdo con una de las reivindicaciones 6 ó 7, en el que la función hepática del probando se deriva por medio de medición de la actividad de los hepatocitos humanos microalbúmina y otras proteínas para la sintetización.

10. Procedimiento in-vitro de acuerdo con una de las reivindicaciones 6 ó 7, en el que la función hepática del probando se deriva por medio de medición de la liberación de lactato-dehidrogenasa a partir de los hepatocitos humanos.

11. Procedimiento in-vitro de acuerdo con una de las reivindicaciones 6 ó 7, en el que la función hepática del probando se deriva por medio de medición de la adherencia de los hepatocitos humanos vitales.

12. Procedimiento in-vitro de acuerdo con una de las reivindicaciones 6 ó 7, en el que la función hepática del probando se deriva por medio de medición de la actividad éster de los hepatocitos humanos vitales.

13. Procedimiento in-vitro de acuerdo con una de las reivindicaciones 6 ó 7, en el que la función hepática del probando se deriva por medio de medición del número de los hepatocitos humanos muertos y del número de los hepatocitos humanos vivos.

14. Procedimiento in-vitro de acuerdo con una de las reivindicaciones 6 ó 7, en el que la función hepática del probando se deriva por medio de medición de la actividad de dehidrogenasas mitocondriales de los hepatocitos humanos vitales.