Proteína recombinante y usos en el diagnóstico de la esclerosis múltiple.

Proteína recombinante y usos en el diagnóstico de la esclerosis múltiple.

Proteína recombinante IFNAR2.3, anticuerpos, composiciones que los comprenden, y usos. Entre sus usos, especialmente, se refiere a un método para el diagnóstico de la esclerosis múltiple, así como al kit de diagnóstico.

Proteína recombinante y usos en el diagnóstico de la esclerosis múltiple.

La presente invención se encuentra dentro del campo de la blomedicina y la biotecnología, y se refiere al receptor soluble IFNAR2.3 aislado, producido de manera recombinante, a un método de diagnóstico de individuos con esclerosis múltiple, a un kit y a sus usos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La esclerosis múltiple (EM) es una enfermedad crónica inflamatoria y desmielinizante del sistema nervioso central (SNC), presumiblemente autoinmune. Se caracteriza por la presencia de lesiones inflamatorias en la sustancia blanca y gris del SNC, denominadas placas, en las que se produce pérdida de mielina y cierto grado de degeneración axonal.

Aunque en los últimos años se han desarrollado numerosos fármacos para paliar los efectos de esta enfermedad, el ¡nterferon beta (IFNIS) sigue siendo el tratamiento más ampliamente utilizado. Numerosos ensayos clínicos han demostrado que disminuye la frecuencia y gravedad de los brotes, el número y volumen de las lesiones cerebrales observadas por resonancia y la progresión en la escala de discapacidad física. Sin embargo, un porcentaje importante de pacientes (30-50%) no responden adecuadamente al tratamiento, ya que continúan con la presencia de brotes y progresan en la escala de discapacldad física.

El IFNÜ ejerce su actividad biológica a través de la interacción con el receptor de superficie IFNAR formado por dos subunidades, IFNAR1 e IFNAR2. Tras la unión del IFNIJ a IFNAR2, se produce la dlmerlzaclón de las dos subunldades y la activación de la cascada de señalización intracelular cuya señal es transduclda al núcleo a través de la vía Jak-Stat. De esta forma se ejercen las actividades antivirales, antiprollferatlvas e ¡nmunomoduladoras del IFNI5.

La subunidad IFNAR2 del receptor sufre un procesamiento alternativo del ARNm que da lugar a tres formas distintas: una forma corta (IFNAR2b), una forma larga funcionalmente activa (IFNAR2c) y la forma soluble (SIFNAR2, IFNAR2.3 o IFNAR2a). Solamente IFNAR2c actúa como receptor funcional junto con IFNAR1 y es capaz de mediar los efectos biológicos del IFNfc. IFNAR2.3 que carece de dominios citoplasmáticos y transmembrana, ha sido Identificada en fluidos biológicos humanos y aunque su papel no está definido, se ha sugerido que pueda tener capacidad neutralizante de la unión del IFNIJ con el receptor IFNAR2. De esta forma podría ejercer funciones moduladoras según la concentración a la que se encuentre; por un lado podría neutralizar la unión del IFNÜ al receptor IFNAR o por el contrario, prolongar la vida media del IFNIJ circulante, impidiendo su degradación o la formación de oligómeros. A día de hoy sigue siendo desconocida la función de la variante soluble de IFNAR2.

El diagnóstico clínico de la EM es complejo. Éste se realiza teniendo en consideración la existencia de criterios clínicos de diseminación espacial (presenta de síntomas y signos que indiquen existencia de dos lesiones independientes en el SNC) y de diseminación temporal (dos o más episodios de disfunción neurológica).

Los estudios de conductividad nerviosa de los nervios ópticos, sensitivos y motores también proporcionan pruebas de la existencia de la enfermedad, ya que el proceso de desmielinización implica una reducción de la velocidad de conducción de las señales nerviosas. El estudio se realiza comparando los tiempos de reacción con mediciones preestablecidas.

El proceso de diagnóstico se completa con la realización de pruebas para excluir otras enfermedades que pueden imitar a la esclerosis como la Enfermedad de Devic, la sarcoidosis, la vasculitis y la enfermedad de Lyme.

Hasta el momento, la prueba paraclínica por excelencia para confirmar el diagnóstico de EM es la presencia de bandas oligoclonales (BOC) en líquido cefalorraquídeo, producidas por células situadas en el espacio subaracnoideo, que dan lugar a síntesis intratecal de IgG. El método más sensible para su detección es el isoelectroenfoque en gel de poliacrilamida, que permite detectar BOC hasta en el 95% de los casos de EM. El principal inconveniente de esta técnica es la necesidad de realizar una punción lumbar al paciente, siendo un método invasivo para el paciente y costoso.

Sería útil, por tanto, encontrar una prueba paraclínica que consiga diagnosticar individuos con EM de una manera mucho menos invasiva, incruenta y por ello, más inocua para el paciente.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

Los autores de la presente invención han desarrollado un método para diagnosticar la esclerosis múltiple, y han diseñado un ELISA cualitativo, tipo sándwich, para la determinación de IFNAR2.3 en suero. Para dar validez a este ensayo, han clonado y purificado la proteína IFNAR2.3, de forma que pueda servir como control positivo para incluir en el ensayo. Se ha realizado la optimización de cada uno de los pasos de la técnica y se ha calculado la variación intraensayo e interensayo de la misma. Una vez desarrollada y optimizada la metodología, se han determinado los valores de IFNAR2 soluble en suero de pacientes con EM y controles sanos.

PROTEÍNA RECOMBINANTE DE LA INVENCIÓN.

Los autores de la invención han clonado y purificado la proteína IFNAR2.3. Además, mediante el método de clonación empleado han añadido una cola de histidina-asparagina en el extremo carboxi terminal, quedando fusionado a la proteína recombinante como una etiqueta. Tras la producción de la proteína recombinante en la célula hospedadora, se hace pasar el lisado celular por una columna de afinidad para su purificación. La proteína de fusión con la etiqueta queda retenida en la columna mientras que las otras proteínas y otros contaminantes son afluidos a través de ésta.

Por tanto, un primer aspecto de la invención se refiere a una proteína recombinante obtenible por un procedimiento que comprende:

a) integrar un inserto con la secuencia nucleotídica SEQ ID NO. 1 en una construcción genética o un vector de expresión,

b) transformar un hospedador con el vector de expresión del paso (a),

c) inducir la expresión de la proteína recombinante,

d) extraer la proteína recombinante, y

e) purificar la proteína recombinante

El diseño del vector basado en técnicas de ingeniería genética y la elección de la célula hospedadora determinan, en gran parte, las características de la proteína recombinante.

La construcción génica de la invención puede comprender, además de la secuencia nucleotídica SEQ ID NO. 1, elementos que regulan la expresión de dicha secuencia. Dichos elementos reguladores incluyen promotores y potenciadores. Los promotores se encuentran típicamente posicionados en posición 5 con respecto al sitio de iniciación de la transcripción o traducción. Los potenciadores son capaces de influenciar la expresión de genes cuando se encuentran en posición 5o 3 'con respecto al ADNc o cuando se encuentran formando parte de un intrón. Secuencias reguladoras incluyen, además de promotores, secuencias que facilitan la traducción, señales de procesamiento para los intrones, codones de terminación, secuencias señales, sitios internos de unión al ribosoma (IRES) y señales de poliadenilación.

El vector de expresión que comprende la secuencia nucleotídica SEQ ID NO. 1 o una construcción génica de la invención, está operativamente acoplado con una secuencia que regula la expresión de dicha secuencia nucleotídica SEQ ID NO. 1 o de dicha construcción génica. El experto en la materia advertirá que el tipo de vector adecuado para la expresión de los ácidos nucleicos y construcciones génicas de la invención, dependerá del organismo en el que se desee expresar el polinucleótido de la invención.

En una realización preferida de este aspecto de la invención, el vector de expresión es el vector prelinearizado pEcoli-Cterm 6xHN Linear.

Una célula o un organismo hospedador puede comprender la construcción génica de la invención o un vector, tal como se ha definido en la invención. En principio, cualquier tipo de organismo hospedador conocido para el experto en la materia puede ser usado en la presente invención, tales como una cepa bacteriana (Escherichia coli, Bacillus subtilis y similares), una cepa de levadura (Saccharomyces cerevisiae, Pichia pastoris, Kluyveromyces lactis, Hansenula polymorpha y similares), una planta transgénica (dicotiledóneas o monocotildoneas), una célula de insecto, por ejemplo, baculovirus, una célula de mamífero (células COS, CHO, C127, HeLa y similares) y un transgénico no humano (por ejemplo, un ratón, una vaca, una cabra, un conejo, un cerdo, etc.).

En otra realización preferida de este aspecto... [Seguir leyendo]

I.- Una proteína recombinante obtenible por un procedimiento que comprende:

a) integrar un inserto con la secuencia nucleotídica SEQ ID NO. 1 en un vector de expresión,

b) transformar un hospedador con el vector de expresión del paso (a),

c) inducir la expresión de la proteína recombinante,

d) extraer la proteína recombinante, y

e) purificar la proteína recombinante.

2- La proteína recombinante según la reivindicación anterior, donde el vector de expresión es el vector prelinearizado pEcoli-Cterm 6xHN Linear.

3.- La proteína recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 1-2, donde el hospedador del paso (b) son bacterias de expresión.

4.- La proteína recombinante según la reivindicación anterior, donde las bacterias de expresión son bacterias E. coli BL21(DE3).

5.- La proteína recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde la integración del paso (a) se realiza mediante un proceso de ligación.

6.- La proteína recombinante según la reivindicación anterior, donde en la ligación se emplea un liofilizado que comprende la enzima In-Fusion.

7.- La proteína recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, donde el inserto se sintetizó empleando los cebadores de secuencia nucleotídica SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6.

8 - Un anticuerpo, o un fragmento del mismo, que reconoce específicamente una proteína recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 1-7.

9 - El anticuerpo o un fragmento del mismo, según la reivindicación anterior, obtenible por inyección de la proteína recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 1-7 en un animal apropiado, y recogida y purificación de los antisueros de los animales.

- El anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 8-9, que es un anticuerpo monoclonal.

II.- Una composición que comprende:

a) una proteína que comprende la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 2,

b) la proteína recombinante según cualquiera de las reivindicaciones 1-7, o

c) el anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 8-10.

12 - La composición según la reivindicación anterior, que es una composición farmacéutica.

13.- El uso de una composición según cualquiera de las reivindicaciones 11-12, en la elaboración de un medicamento.

14.- El uso de una composición según cualquiera de las reivindicaciones 11-12, en la elaboración de un medicamento para el tratamiento de la esclerosis múltiple.

15.- Un método de obtención de datos útiles, para el diagnóstico de individuos con esclerosis múltiple, que comprende:

a) obtener una muestra biológica aislada de un individuo, y

b) detectar el producto de expresión de IFNAR2.3

16.- Un método de obtención de datos útiles según la reivindicación anterior, que además comprende:

c) comparar las cantidades obtenidas en el paso (b) con una cantidad de referencia.

17.- El método según cualquiera de las reivindicaciones 15-16, donde los pasos (b) y/o (c) de los métodos descritos anteriormente pueden ser total o parcialmente automatizados.

18.- El método según cualquiera de las reivindicaciones 15-17, donde la muestra biológica es suero.

19.- El método según cualquiera de las reivindicaciones 15-18, donde la cuantificación se hace mediante un inmunoensayo.

20.- El método según la reivinidcación 19, donde el inmunoensayo es un ELISA.

21.- El método según cualquiera de las reivindicaciones 19-20, donde el inmunoensayo es un ELISA sándwich.

22.- Un método de diagnóstico, pronóstico y clasificación de individuos que comprende los pasos (a)-(c) según cualquiera de las reivindicaciones 15-21, y que además comprende asignar al individuo del paso (a) al grupo de individuos con esclerosis múltiple cuando presentan un valor superior a 2,14 por encima del punto de corte establecido en la curva ROC.

23. Un método de diagnóstico, pronóstico y clasificación de individuos que comprende los pasos (a)-(c) según cualquiera de las reivindicaciones 15-21, y que además comprende asignar al individuo del paso (a) al grupo de individuos sin esclerosis múltiple cuando presentan un valor inferior a 1,14 por debajo del punto de corte establecido en la curva ROC.

24.- Un kit o dispositivo, que comprende los elementos necesarios para cuantificar el producto de expresión de IFNAR2.3.

25.- El kit o dispositivo según la reivindicación anterior, que comprende un anticuerpo según se describe en cualquiera de las reivindicaciones 8-10.

26.- Un kit o dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 24-25, que comprende una proteína recombinante según se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1-7.

27 - Un kit o dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 24-26, que además comprende:

a) un soporte sólido que lleva unido un anticuerpo primario

b) anticuerpo secundario

c) una solución del anticuerpo de detección, marcado con un marcador enzimático; y

d) un reactivo.

28.- Un kit o dispositivo según la reivindicación anterior, donde el anticuerpo primario comprende la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 3.

29.- Un kit o dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 27-28, donde el anticuerpo secundario comprende la secuencia aminoacídica SEQ ID NO: 4.

30.- El uso de un kit o dispositivo según cualquiera de las reivindicaciones 24 a 29, para llevar a cabo un método según se describe en cualquiera de las reivindicaciones 15 -23.

31.- Un medio de almacenamiento legible por un ordenador que comprende instrucciones de programa capaces de hacer que un ordenador lleve a cabo los pasos del método según cualquiera de las reivindicaciones 15 -23.

32.- Una señal transmisible que comprende instrucciones de programa capaces de hacer que un ordenador lleve a cabo los pasos del método según cualquiera de las reivindicaciones 15 -23.