Un procedimiento para identificar uno o más péptidos inmunomoduladores,

que comprende las etapas de:

cultivar células inmunes aisladas de un sujeto con un grupo de varios péptidos solapantes de una biblioteca de péptidos solapantes;

analizar simultáneamente un sobrenadante de un medio de cultivo con respecto a múltiples parámetros de reactividad inmune que comprenden la especificidad y la respuesta de citocinas de citocinas y quimiocinas, lo cual permite la identificación de fenotipos de células de Tipo 1, de Tipo 2 y T-Reguladoras contra el grupo de varios péptidos solapantes;

cultivar células inmunes aisladas del sujeto con péptidos individuales del grupo de péptidos solapantes y analizar simultáneamente el sobrenadante del medio de cultivo con respecto a dichas citocinas y quimiocinas; y

determinar el tipo de respuesta inmune basándose en la expresión coordinada de citocinas en respuesta a los péptidos individuales en el medio de cultivo

Procedimiento de evaluación de la respuesta inmune.

Campo técnico de la invención

La presente solicitud se refiere a procedimientos para la identificación de péptidos inmunomoduladores y, más particularmente, a un nuevo procedimiento para la identificación de péptidos antigénicos mediante análisis múltiple de la respuesta inmune.

Antecedentes de la invención

El sistema inmune proporciona protección frente a agresiones microbianas. En su misma esencia es un sistema complejo ya que debe ser capaz de reconocer y adaptarse a amenazas siempre cambiantes limitando al mismo tiempo los daños colaterales en los tejidos propios. Es una consecuencia de esta complejidad que la disfunción inmune, tanto hiper- como hipo- actividad, esté en la raíz de muchas enfermedades humanas. El sistema inmune adaptativo (compuesto por células B y células T) reconoce antígenos en forma de patrones moleculares tales como péptidos, glicopéptidos, fosfopéptidos y lípidos, unidos a y presentados en el contexto de clases especializadas de moléculas presentadoras de antígeno. Los fragmentos derivados de antígenos, por ejemplo, péptidos que son reconocidos por las células T, se denominan epítopes. Está ampliamente aceptado que el reconocimiento por una célula T de su epítope específico es el acontecimiento central en la función inmune adaptativa.

Estas moléculas presentadoras de antígenos especializadas incluyen: i) las proteínas clásicas de antígeno leucocitario humano (HLA) que son altamente polimórficas y pueden separarse en dos clases principales, la Clase I y la Clase II; ii) el grupo no clásico que está codificado por los subloci de HLA E, F y G (Braud VM, Curr Opin Immunol. 1999 Feb; 11(1): 100-8), y iii) la familia CD1 de moléculas presentadoras de antígeno (Bendelac A, Science. 1995 Jul 14; 269(5221): 185-6). Las moléculas de HLA de Clase I están codificadas por los loci de HLA A, B y C y presentan péptidos de 8-10 aminoácidos (AA) a células T citotóxicas CD8+ (Adams EJ, Immunol Rev. 2001 Oct; 183: 41-64). Las moléculas de HLA de Clase II presentan péptidos de 12-16 AA a células T auxiliares CD4+ y están codificadas por los loci de HLA DR, DP y DQ (Korman AJ, Immunol Rev. 1985 Jul; 85: 45-86). Las células T reconocen antígenos sólo en el contexto de moléculas presentadoras de antígeno, y sólo después de un procesamiento y presentación apropiadas de los antígenos. Para la presentación de antígenos dependiente de HLA, el procesamiento de antígenos consiste habitualmente en la fragmentación proteolítica de la proteína, dando como resultado polipéptidos que caben en la hendidura de la molécula de HLA y este complejo de péptido/HLA se presenta posteriormente en la superficie celular de la célula presentadora de antígeno a la célula T (Rock, K, Adv Immunol. 2002; 80: 1-70, Cresswell P, Curr Biol. 1994 Jun 1; 4(6): 541-3). El grupo no clásico está codificado por los subloci de HLA E, F y G y está caracterizado por un bajo grado de polimorfismo y una capacidad para unirse y presentar un conjunto limitado de péptidos a células efectoras inmunes. El reconocimiento de péptidos presentados por moléculas de HLA no clásicas se ha demostrado que es importante en la inducción de la inmunotolerancia en áreas tales como la interfaz materno-fetal y/o la inmunidad tumoral. El otro grupo importante entre estas moléculas especializadas es la familia CD1, que está implicada en la presentación de lípidos tales como glicolípidos bacterianos a células efectoras especializadas en el sistema inmune.

Tres tipos principales de inmunidad de células T puede seguir al reconocimiento de antígenos: Tipo 1 (Th1), Tipo 2 (Th2) y Reguladora (T-Reguladora). La inmunidad de Tipo 1 es importante para la eliminación de patógenos intracelulares y la inmunidad antitumoral y se caracteriza principalmente por la expresión de IFN gamma (IFN-?). La inmunidad de Tipo 2 es crítica para la eliminación de patógenos extracelulares y se caracteriza principalmente por la expresión de citocinas tales como IL-4, IL-5, IL-9 e IL-13. El tipo de inmunidad T-Reguladora, mediada por citocinas tales como IL-10 o TGF-beta, es esencial para la generación y mantenimiento de la autotolerancia. Estos tres tipos de respuesta no se limitan a las células T CD8+ TCR+ alfa/beta clásicas y también pueden estar mediadas por células T CD8+ TCR+ gamma/delta así como por células asesinas naturales (NK) y células T NK. Por lo tanto, el reconocimiento de epítopes antigénicos específicos por cualquiera de estos tipos celulares conduce a su activación y respuesta distintiva especializada. La calidad de una respuesta inmune puede describirse por lo tanto por observación de la expresión coordinada de patrones de citocinas (Tipo 1, Tipo 2 y T-Reguladora).

La activación de una respuesta de células T apropiada durante el transcurso de una reacción inmune implica a menudo la dominancia de una respuesta especializada sobre las otras. Esta activación selectiva de una respuesta de células T especializada apropiada es un determinante crítico para el resultado de la enfermedad. Un ejemplo sorprendente de esto se demuestra en la respuesta de pacientes a la lepra, en la que una respuesta de Tipo 1 a la infección se caracteriza por una inmunidad protectora y una respuesta de Tipo 2 conduce a menudo a una enfermedad mortal. En otro ejemplo drástico respecto a la inmunidad tumoral, se ha demostrado que epítopes tolerogénicos que conducen a un cambio inapropiado hacia una respuesta T-Reguladora dan como resultado una progresión tumoral posterior en seres humanos, mientras que la activación de respuestas de Tipo 1 por epítopes antigénicos tumorales se asocia con la inhibición del crecimiento tumoral. Además, un cambio inapropiado lejos de una respuesta T-Reguladora puede conducir al desarrollo de una enfermedad autoinmune si se presenta un autoantígeno. El cuadro clínico específico de una enfermedad autoinmune dependerá de la respuesta dominante: de Tipo 1 como en el caso de la diabetes de Tipo 1 o de Tipo 2 como el caso de la alergia.

Como la activación de estas respuestas de células T especializadas depende de la presentación de epítopes específicos a las mismas, por lo tanto sería ventajoso identificar estos epítopes peptídicos. Por medio de la identificación de estos epítopes de células T especializadas en las primeras fases de la patología, surge la oportunidad de potenciar respuestas de células T apropiadas o eliminar respuesta de células T inapropiadas y, por lo tanto, de cambiar el equilibrio de la respuesta inmune para mejorar el desenlace de la enfermedad. Una metodología para la identificación cuantitativa y la caracterización cualitativa de estos epítopes antigénicos de células T es una base importante para el diseño de vacunas así como para estrategias de diagnóstico y terapéuticas para enfermedades infecciosas, autoinmunes y neoplásicas.

El documento WO 2004/005925 A2 describe un procedimiento de diagnóstico en un individuo de una exposición reciente a un antígeno, que es, por ejemplo, un patógeno o una vacuna. El procedimiento comprende determinar in vitro si las células T del individuo reconocen una proteína de dicho agente.

El documento WO 99/36568 se refiere al análisis de citocinas en una célula T para determinar una respuesta de células T contra un péptido en las 6 horas siguientes a la exposición de la célula T al péptido.

Haselden y col., Journal of Allergy and Clinical Immunology, 108 (3), 2001: 349-356 desvela reacciones alérgicas mediadas por células mononucleares de sangre periférica.

Holen y col., Clinical and Experimental Allergy, 31(6), 2001: 952-964 desvela epítopes del ovomucoide de pollo que inducen respuestas de células T.

Early y col., Cytometry 50(5), 2002: 239-242 se refiere a inmunoensayos múltiples para citocinas humanas.

Karlsson y col., Journal of Immunology Methods 283(1-2), 2003: 141-153 se refiere a un ELISPOT y citometría de flujo de citocinas para determinar células T específicas de antígeno.

Sumario de la invención

La presente invención incluye procedimientos para identificar uno o más péptidos inmunomoduladores por cultivo de células inmunes aisladas de un sujeto con un grupo de varios péptidos solapantes de una biblioteca de péptidos solapantes; analizar simultáneamente un sobrenadante de un medio de cultivo para determinar múltiples parámetros de reactividad inmune que comprenden la especificidad y la respuesta de citocinas y quimiocinas, lo cual permite la identificación de fenotipos de células de Tipo 1, de Tipo 2 y T-Reguladoras contra el grupo de...

1. Un procedimiento para identificar uno o más péptidos inmunomoduladores, que comprende las etapas de:

2. El procedimiento de la reivindicación 1, que comprende además identificar células efectoras específicas de péptido.

3. El procedimiento de la reivindicación 1, que comprende además identificar múltiples células efectoras específicas de fragmentos peptídicos.

4. Un procedimiento para evaluar el estado inmune de un sujeto, que comprende las etapas de:

5. El procedimiento de la reivindicación 4, caracterizado porque se evalúa el grado de inmunosupresión del sujeto.

6. El procedimiento de la reivindicación 4, caracterizado porque se evalúa el grado de hiperactivación del sistema inmune del sujeto.

7. El procedimiento de la reivindicación 4, caracterizado porque se evalúa el estado inmune de un sujeto con respecto a múltiples péptidos inmunomoduladores para proporcionar un repertorio completo de células T para el sujeto.

8. El procedimiento de la reivindicación 4, caracterizado porque el péptido inmunomodulador y el tipo de reactividad inmune son indicativos del riesgo del sujeto de enfermedades relacionadas con el sistema inmune.

9. El procedimiento de la reivindicación 8, caracterizado porque las enfermedades relacionadas con el sistema inmune se seleccionan del grupo constituido por enfermedades infecciosas, enfermedades autoinmunes, enfermedades autoinflamatorias, cáncer, inflamación crónica y alergia.

10. El procedimiento de la reivindicación 4, que comprende demás predecir la respuesta del sujeto a terapia por determinación del estado inmune específico de epítope del sujeto como indicador del resultado del tratamiento.

11. El procedimiento de la reivindicación 10, caracterizado porque la terapia es inmunoterapia, tal como vacunación, inmunoterapia pasiva y transferencia de células adoptivas.

12. Un procedimiento para identificar y caracterizar nuevos agentes terapéuticos para inmunoterapia que comprende las etapas de:

13. El procedimiento de la reivindicación 12, caracterizado porque los agentes terapéuticos son una combinación de péptidos inmunomoduladores que dirigen el tipo de respuesta inmune hacia Th1, Th2, Tc1, Tc2 y combinaciones de las mismas.

14. El procedimiento de la reivindicación 12, caracterizado porque los nuevos agentes terapéuticos son epítopes vacunales.

15. El procedimiento de la reivindicación 14, caracterizado porque las secuencias del uno o más péptidos se determinan después del aislamiento.

16. El procedimiento de la reivindicación 14, caracterizado porque el agente antigénico comprende un virus, una bacteria, un hongo, un protozoo, un parásito o un helminto.

17. El procedimiento de la reivindicación 14 ó 16, caracterizado porque el agente antigénico es un auto-antígeno.

18. El procedimiento de las reivindicaciones 14 a 17, caracterizado porque el cultivo celular se analiza y se determina el perfil de secreción de citocinas de una o más células T, células B, células dendríticas, monocitos, neutrófilos, mastocitos y eritrocitos.