Antígenos multivariables en complejo con anticuerpo monoclonal humanizado de dirección.

Una vacuna que comprende un anticuerpo monoclonal recombinante (rAb) que comprende un dominio específico de antígeno unido a uno o más dominios que comprenden una primera mitad de un par de unión de cohesina- dockerina,

la primera mitad del par de unión de cohesina-dockerina unida a una segunda mitad del par de unión de cohesina-dockerina, la segunda mitad caracterizada por que es complementaria de la primera mitad y además caracterizada por que la segunda mitad del par de unión de cohesina-dockerina está en una proteína de fusión con un antígeno; y

el dominio específico de antígeno caracterizado por que se dirige al MHC de clase I, MHC de clase II, CD1, CD2, CD3, CD4, CD8, CD11b, CD14, CD15, CD16, CD19, CD20, CD29, CD31, CD40, CD43, CD44, CD45 , CD54, CD56, CD57, CD58, CD83, CD86, CMRF-44, CMRF-56, DCIR, DC-ASPGR, CLEC-6, CD40, BDCA-2, MARCO, DEC-205, receptor de manosa, Langerina, DECTIN-1, B7-1, B7-2, receptor de IFN-γ, receptor de IL-2, ICAM-1, receptor de Fcγ u otro receptor expresado específicamente por células presentadoras de antígenos

Antígenos multivariables en complejo con anticuerpo monoclonal humanizado de dirección Campo técnico de la invención

La presente invención se refiere en general al campo de vacunas nuevas y, más particularmente, al diseño, fabricación y uso de antígenos multivariables en complejo con anticuerpos monoclonales humanizados de dirección.

Antecedentes de la invención

Sin limitar el alcance de la invención, su fondo se describe en relación con el desarrollo de vacunas.

La tecnología de ingeniería proteica en relación con anticuerpos monoclonales está altamente avanzada con respecto a la humanización (es decir, introducción de, por ejemplo, una secuencia de mAb de roedor en una secuencia de mAb humana conservando a la vez sitios de combinación de antígenos específicos del mAb original) y producción (típicamente secretado de líneas celulares de mamíferos). En investigación y desarrollo hay nuevas aplicaciones de rAb relacionadas con la vacunación y se basan en la actualidad en proteínas de fusión de rAb- antígeno modificadas por ingeniería genética (típicamente con la región codificante de antígeno colocada en fase con el codón C terminal de la cadena pesada o H de rAb). Un obstáculo para esta tecnología es la expresión y producción exitosas de rAb-antígeno completamente funcional. En muchos casos, quizá en la mayoría, el antígeno deseado confunde la secreción de rAb-antígeno obtenido por ingeniería genética. Además, la probabilidad de expresión escasa o nula aumenta si la entidad deseada incluye múltiples regiones codificantes de antígeno.

Deyev et al., Nature Biotechnology, vol. 21, n° 12, 1 de diciembre de 23 (1-12-23), páginas 1486-1492, desvela sistemas de multimerización que comprenden, por ejemplo, el módulo de barnasa-barstar, para producir por ejemplo anticuerpos multivalentes y para purificación. El documento EP 1 441 3 A1 desvela la expresión de moléculas de fusión de cohesina o dockerina en células de E. coli o de insecto, y su uso para purificación de proteínas.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a vacunas, vectores, células y métodos de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 6.

La invención proporciona métodos para el ensamblaje de complejos del antígeno de rAb de una manera controlada mediante mezcla sencilla de componentes y acomoda la capacidad para expresar y producir el rAb y antígeno o antígenos en diferentes sistemas de expresión - producción que están más adaptados para el rAb individual y antígeno particular. Además, la invención demuestra la nueva aplicación de la interacción de cohesina-dockerina de alta afinidad y de alta especificidad con sistemas de expresión de mamíferos secretados, permitiendo de este modo el desarrollo de formatos de ingeniería proteica únicos y producción de nuevas herramientas proteicas para investigación y la aplicación clínica.

Más particularmente, la presente invención usa los dominios de proteína cohesina-dockerina y su enlazador circundante. Por ejemplo, la invención permite el ensamblaje controlado de anticuerpos monoclonales recombinantes (rAb) en complejo con antígenos, toxinas o agentes activadores celulares. La invención tiene amplia aplicación potencial en vacunación y terapia de cáncer.

La invención se basa en componentes particulares del complejo de proteína de degradación de celulosa bacteriana bien estudiado llamado el celulosoma. Específicamente, se utilizan dos dominios proteicos (cohesina y dockerina) y secuencias enlazadoras de proteínas naturales mediante la invención en nuevos contextos y aplicaciones.

La presente invención se basa en el descubrimiento de que dominios particulares de cohesina y dockerina pueden secretarse con éxito y eficazmente de células de mamífero como proteínas de fusión manteniendo al mismo tiempo la interacción proteína-proteína de cohesina-dockerina de alta afinidad y específica. Aunque la bibliografía exhaustiva de cohesina-dockerina enseña la expectativa de que dichas proteínas de fusión deberían tener esta funcionalidad, no describe la producción de dichas proteínas de fusión en sistemas de secreción de mamíferos. El estado del conocimiento científico no permite la predicción del descubrimiento ya que las reglas (aparte de elementos tales como el péptido señal) para la secreción exitosa no están completamente establecidas. Además, se sabe que las regiones de enlazador de cohesina están glucosiladas en sus bacterias nativas, y los dominios de cohesina y dockerina contienen sitios de glucosilación predichos. Aunque esto puede favorecer de hecho la secreción de células de mamífero, no está claro si la glucosilación "no natural" alterará la interacción de cohesina- dockerina.

Aunque se ha publicado la interacción de cohesina-dockerina para diversas aplicaciones comerciales, la presente invención se basa en un potencial no realizado previamente para esta interacción basado en el ensamblaje de complejos proteicos específicos no relacionados con las aplicaciones de enzimas de ensamblaje controlado.

La invención incluye el uso de todas las secuencias de cohesina-dockerina de diversos microbios degradantes de celulosa, pero describe la aplicación de secuencias de cohesina y dockerina y enlazador específicas del microbio Clostridium thermocellum. Por ejemplo, la secuencia descrita en el presente documento codifica la cadena H de un lgG4 humano unido en el codón C-terminal con una secuencia de dockerina de Clostridium thermocellum (denominada rAb.doc). Otras realizaciones de las proteínas rAb.doc se describen de forma similar con ejemplos que se modifican por ingeniería genética transfiriendo simplemente la región codificante de dockerina como un fragmento de ADN a vectores que codifican las diferentes entidades de cadena H.

Más particularmente, la presente invención incluye un transportador de rAb modular que incluye un dominio de unión específico de antígeno unido a uno o más dominios transportadores de antígeno y una mitad de un par de unión de cohesina-dockerina. El dominio de unión específico de antígeno puede ser al menos una parte de un anticuerpo y el anticuerpo es una proteína de fusión con y el par de unión en una proteína de fusión con una mitad de un par de unión de cohesina-dockerina. El rAb también puede incluir una mitad complementaria del par de unión de cohesina- dockerina unido con un antígeno que forma un complejo con el vehículo de rAb modular. La mitad complementaria del par de unión de cohesina-dockerina puede en sí mismo ser una proteína de fusión con el antígeno transportado como parte del complejo (complejo de antígeno (cohesina-dockerina) de vehículo de rAb modular). Los ejemplos de dominio específico de antígeno incluyen un anticuerpo de longitud completa, un dominio de región variable de anticuerpo, un fragmento Fab, un fragmento Fab, un fragmento F(ab)2 y un fragmento Fv, y un fragmento Fabc y/o un fragmento Fab con partes de dominio Fe. Los ejemplos no limitantes de fuentes para el par de unión de cohesina- dockerina incluyen Clostridium thermocellum, Clostridium josui, Clostridium cellulolyticum y Bacteroides cellulosolvens y combinaciones de los mismos.

El dominio de unión específico de antígeno se dirige a un marcador de superficie celular seleccionado de MFIC de clase I, MHC de clase II, CD1, CD2, CD3, CD4, CD8, CD11 b, CD14, CD15, CD16, CD19, CD2, CD29, CD31, CD4,CD43, CD44, CD45, CD54, CD56, CD57, CD58, CD83, CD86, CMRF-44, CMRF-56, DCIR, DC-ASPGR, CLEC-6, CD4, BDCA-2, MARCO, DEC-25, receptor de mañosa, Langerina, DECTIN-1, B7-1, B7-2, receptor de IFN-y y receptor de IL-2, ICAM-1, receptor de Fcy u otro receptor expresado de forma relativamente específica por células presentadoras de antígeno.

El rAb de la presente invención también puede incluir combinaciones de los dominios que se definen como: un rAb.Doc; un rAb.Coh; un rAb.(Coh)x; un rAb.(Doc)x; un rAb.(Coh.Doc)x; o un rAb.(Coh)x(Doc)x; en los que x es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 1 o más. Los ejemplos del vehículo de rAb modular en un complejo incluyen:

un rAb.Doc:Coh.antígeno;

un rAb.Coh:Doc.antígeno;

un rAb.(Coh)x:(Doc.antígeno)x;

un rAb.(Doc)x:(Coh.antígeno)x;

un rAb.(Coh.Doc)x:(Doc.antígeno1)(Coh.antígeno2); o

un rAb.(Coh)x(Doc)x:(Doc.antígeno1)x(Coh.antígeno2)x;

en los que x es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 1.

La presente invención también incluye una vacuna de un vehículo de rAb modular que incluye un dominio específico de antígeno unido a uno o más dominios que comprenden una mitad del par de unión de cohesina-dockerina unido con una mitad complementaria del par de unión de cohesina-dockerina unido con un antígeno. El rAb se une con una... [Seguir leyendo]

1. Una vacuna que comprende un anticuerpo monoclonal recombinante (rAb) que comprende un dominio específico de antigeno unido a uno o más dominios que comprenden una primera mitad de un par de unión de cohesina- dockerina, la primera mitad del par de unión de cohesina-dockerina unida a una segunda mitad del par de unión de cohesina-dockerina, la segunda mitad caracterizada por que es complementaria de la primera mitad y además caracterizada por que la segunda mitad del par de unión de cohesina-dockerina está en una proteína de fusión con un antígeno; y

el dominio específico de antígeno caracterizado por que se dirige al MHC de clase I, MHC de clase II, CD1, CD2, CD3, CD4, CD8, CD11b, CD14, CD15, CD16, CD19, CD2, CD29, CD31, CD4, CD43, CD44, CD45 , CD54, CD56, CD57, CD58, CD83, CD86, CMRF-44, CMRF-56, DCIR, DC-ASPGR, CLEC-6, CD4, BDCA-2, MARCO, DEC-25, receptor de mañosa, Langerina, DECTIN-1, B7-1, B7-2, receptor de IFN-y, receptor de IL-2, ICAM-1, receptor de Fcy u otro receptor expresado específicamente por células presentadoras de antígenos.

2. La vacuna de la reivindicación 1, en la que la vacuna se define además como:

un rAb.Doc:Coh.antígeno; un rAb.Coh:Doc.antígeno; un rAb.(Coh)x:(Doc.antígeno)x; un rAb.(Doc)x:(Coh.antígeno)x; un rAb.(Coh.Doc)x:(Doc.antígeno1)(Coh.antígeno2); o un rAb. (Coh)x(Doc)x: (Doc.antígeno1)x(Coh.antígeno2)x;

en los que "Doc" representa un dominio de dockerina, "Coh" representa un dominio de cohesina, representa una fusión entre el polipéptido antes y el polipéptido después del representa una interacción entre cohesina y dockerina que da como resultado la formación de un complejo y en los que "x" es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 1.

3. Un ácido nucleico aislado que comprende un segmento que codifica un rAb.Doc;

un rAb.Coh; un rAb (Coh)x; un rAb (Doc)x; un rAb (Coh.Doc)x; o un rAb (Coh)x (Doc)x;

en los que "Doc" representa un dominio de dockerina, "Coh" representa un dominio de cohesina, representa una fusión entre el polipéptido antes de y el polipéptido después del y en los que "x" es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 1.

4. Un vector que comprende un ácido nucleico que codifica un anticuerpo monoclonal recombinante (rAb) como se define en la reivindicación 1 o 2.

5. Una célula hospedadora aislada que comprende un vector de acuerdo con la reivindicación 4.

6. Un método para preparar un rAb como se define en la reivindicación 1 o 2 que comprende:

combinar un dominio específico de antígeno unido con uno o más dominios que comprenden una mitad de un par de unión de cohesina-dockerina.