Proteína que comprende la secuencia de aminoácidos tal como se muestra en la SEQ ID NO: que tiene actividad endoglucanasa

Endoglucanasas y preparaciones de celulasa que las contienen.

Antecedentes de la invención

La presente invención se refiere a endoglucanasas y a preparaciones de celulasa que las contienen, así como a métodos para tratar con las preparaciones de celulasa tejidos que contienen celulosa, papel, pasta papelera o alimentos para animales.

El tratamiento con celulasa de tejidos que contienen celulosa tiene el fin de proporcionar a los tejidos las propiedades deseadas. Por ejemplo, en la industria de las fibras el tratamiento con celulasa se lleva a cabo con el fin de mejorar el tacto y el aspecto de los tejidos que contienen celulosa o para dar a los tejidos coloreados que contienen celulosa un aspecto de material de "lavado a la piedra", es decir un cambio de color parcial (Patente Europea Nº 307.564).

Por otra parte, recientemente el liocel, que es una fibra de celulosa regenerada preparada a partir de celulosa derivada de pasta papelera mediante un proceso de hilatura con disolventes orgánicos, ha llamado la atención por sus propiedades (tal como alta resistencia, absorción del agua) y por el proceso de producción, que provoca una menor contaminación ambiental. Sin embargo, debido a que el liocel genera pelusas durante su producción, se considera desde el punto de vista comercial que el liocel en esta forma tienen un valor bajo como tejido. Por ello, se han propuesto métodos para eliminar la pelusa que se genera durante la producción utilizando celulasas.

El término "tejidos que contienen celulosa" empleado aquí incluye tejidos preparados a partir de materiales de fibra celulósica tales como celulosa natural (por ejemplo algodón, lino), celulosa regenerada (por ejemplo liocel, rayón, rayón polinósico, de cupramonio); telas tejidas o de punto a partir de estas fibras; y artículos de vestir preparados cosiendo estas telas. Además, estos tejidos, telas y artículos de vestir cosidos que comprenden el o los materiales de fibra celulósica y otro u otros materiales, como fibra sintética, lana o seda, están incluidos también en este término.

Actualmente, se utilizan principalmente celulasas derivadas de Trichoderma y Humicola (ambos son hongos de la pudrición de la madera) en el tratamiento de los tejidos que contienen celulosa. Estas celulasas son mezclas de varios componentes celulasas. El uso práctico de estas celulasas se ve impedido por la dificultad de necesitar una gran cantidad de preparación de celulasa para lograr el efecto deseado sobre el tejido que contiene celulosa.

El inconveniente descrito anteriormente de estas preparaciones de celulosa está siendo mejorado por el desarrollo de preparaciones que contienen gran cantidad de endoglucanasas. Por ejemplo, se describen diversas preparaciones de celulasa enriquecidas con endoglucanasa en WO 89/09259, WO 91/17243, WO 98/03640, EP 0633311A y WO 94/21801. En particular, la WO 91/17243 describe que un componente purificado de endoglucanasa de 43 kD derivada de Humicola (EGV) muestra una actividad decolorante en pantalones vaqueros aproximadamente 100 veces mayor que la actividad de aquellas preparaciones convencionales de celulasa que son mezclas de varios componentes celulasa. La WO 98/03640 describe que un componente de endoglucanasa derivado de Humicola NCE4 muestra una actividad decolorante en pantalones vaqueros y una actividad eliminadora de pelusa en liocel que son respectivamente 25 veces y 100 veces más importantes que aquellas de las preparaciones convencionales de celulasa. Sin embargo, para eliminar la intensa pelusa generada en los tejidos de celulosa regenerada, tales como liocel, se necesitan preparaciones de celulasa que contengan componentes de endoglucanasa de actividad todavía mayor para utilizarlas en la práctica a escala industrial. La EP 0 843 041 A1 describe el uso de una celulosa monocomponente, preferentemente una endoglucanasa monocomponente, que se obtiene a partir de Thielavia terrestris, para la decoloración de pantalones vaqueros.

Generalmente, el procesamiento de tejidos que contienen celulosa incluye el refinado, blanqueo, teñido y mercerización; todos ellos se llevan a cabo bajo condiciones alcalinas. Sin embargo, en las preparaciones convencionales de celulosa descritas anteriormente y que contienen gran cantidad de endoglucanasa, aquellas que derivan de Trichoderma tienen un pH óptimo en un rango ácido y aquellas que derivan de Humicola tienen un pH óptimo en un rango neutro. Por tanto, cuando se utilizan estas preparaciones de celulasa, el tratamiento de la celulasa debe llevarse a cabo separadamente de las etapas de procesamiento de tejido mencionadas anteriormente, después de ajustar el pH mediante la adición de tampones, etc.

En consecuencia, si se dispusiera de un componente de endoglucanasa que funcionara bajo condiciones alcalinas, el tratamiento de la celulasa se podría llevar a cabo según las etapas de procesamiento de tejidos mencionadas anteriormente. Así, se podrían acortar las etapas de producción. Como consecuencia, se cree que se podría lograr una reducción importante del coste.

Se describe que las celulasas derivadas de Rhizopus son capaces de conservar su actividad bajo condiciones alcalinas (Publicaciones Japonesas de Patentes No Examinadas Nº 60-226599, 64-40667, 64-26779 y 7-90300). En todos estas descripciones, las preparaciones de cultivos de Rhizopus se utilizan con el propósito de proporcionar detergentes para su uso en el lavado/aclarado de las telas. Sin embargo, la actividad de estas preparaciones de cultivos de Rhizopus es extremadamente baja y, con diferencia, por debajo del nivel necesario para su uso práctico.

A menudo se proporcionan preparaciones de celulasa altamente activas como preparaciones que contienen gran cantidad de endoglucanasa tal como se ha descrito anteriormente. Para preparar dicha endoglucanasa, se conocen métodos en los que un componente de interés de la endoglucanasa se expresa de forma recombinante y en gran cantidad en una célula huésped, tal como se describe en WO 91/17243, WO 98/03667 y WO 98/111239. Ejemplos de células huésped preferentes en estos métodos incluyen hongos filamentosos que pertenecen a Deuteromycotina, por ejemplo Aspergillus, Humicola y Trichoderma. Si se considera la producción de enzimas a escala industrial, estos hongos filamentosos que pertenecen a Deuteromycotina son excelentes huéspedes.

Sin embargo, cuando un gen heterogéneo se expresa en estos hongos filamentosos que pertenecen a Deuteromycotina, con frecuencia la alta expresión se ve impedida por razones tales como la diferencia en el uso del codón. En particular, no se ha informado sobre la alta expresión de un gen derivado del género Rhizopus que pertenece a Zygomycotina en los hongos filamentosos mencionados anteriormente que pertenecen a Deuteromycotina. Por tanto, se desea una tecnología de alta expresión.

Recientemente y en estas circunstancias, se viene elaborando una tecnología que consigue la alta expresión de un gen de interés en una célula huésped mediante la optimización de los codones del gen conforme a la frecuencia de los codones de la célula huésped. Se presupone un uso óptimo de los codones para la alta expresión de un gen de interés en un huésped mediante un examen de la frecuencia de los codones en aquellos genes expresados de forma relativamente abundante en el huésped en su entorno natural. Esto se apoya en el informe de Lloyd y col., (Andrew T. Lloyd y Paul M. Sharp, 1991, Mol. Gen. Genet. 230, 288-294) con respecto a la frecuencia de los codones en Aspergillus nidulans, hongo filamentoso que pertenece a Deuteromycotina. Sin embargo, aunque se ha obtenido información sobre el uso apropiado de los codones a partir de secuencias conocidas de ADN, tal información no resulta necesariamente en una alta expresión de un gen de interés inmediatamente. Especialmente, en hongos filamentosos, cuyo control es complejo, es necesaria la selección de una sola secuencia que sea la más adecuada para la expresión de un número de secuencias con el uso adecuado de codones.

Sumario de la invención

Los presentes inventores han aislado endoglucanasas altamente activas y genes de las mismas procedentes de hongos Zygomycotina, Rhizopus oryzae, Mucor circinelloides y Phycomyces nitens. Los inventores han descubierto que estas enzimas muestran actividades extremadamente importantes en la eliminación de la pelusa de tejidos de celulosa...

1. Proteína que comprende la secuencia de aminoácidos tal como se muestra en la SEQ ID NO: que tiene actividad endoglucanasa.

2. Polinucleótido que comprende una secuencia nucleotídica que codifica la proteína según la reivindicación 1.

3. Polinucleótido según la reivindicación 2, caracterizado porque dicho polinucleótido comprende la secuencia de ADN tal como se muestra en la SEQ ID NO:2.

4. Polinucleótido según la reivindicación 2 ó 3, caracterizado porque dicho polinucleótido comprende una secuencia nucleotídica en la que los codones han sido optimizados para un huésped mediante la selección de aquellos codones utilizados frecuentemente por el huésped.

5. Vector de expresión que comprende el polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4.

6. Célula huésped transformada con el polinucleótido según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4 o con el vector de expresión según la reivindicación 5.

7. Célula huésped según la reivindicación 6, caracterizada porque dicha célula huésped es una levadura o un hongo filamentoso.

8. Célula huésped según la reivindicación 7, caracterizada porque la levadura pertenece al género Saccharomyces, al género Hansenula o al género Pichia.

9. Célula huésped según la reivindicación 7, caracterizada porque la levadura es Saccharomyces cerevisiae.

10. Célula huésped según la reivindicación 7, caracterizada porque el hongo filamentoso pertenece al género Humicola, al género Aspergillus, al género Trichoderma, al género Acremonium o al género Fusarium.

11. Célula huésped según la reivindicación 7, caracterizada porque el hongo filamentoso es Humicola insolens, Aspergillus niger o Trichoderma viride.

12. Método para producir la proteína según la reivindicación 1, que comprende el cultivo de la célula huésped según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 11 así como la recuperación de la proteína de dicha célula huésped y/o del caldo de cultivo resultante.

13. Endoglucanasa producida por medio del método según la reivindicación 12.

14. Preparación de celulasa que comprende la proteína según la reivindicación 1 y uno o más componentes seleccionados de entre excipientes, agentes tensioactivos y conservantes.

15. Método para tratar tejidos que contienen celulosa, que comprende una etapa que consiste en poner en contacto el tejido que contiene celulosa con la proteína según la reivindicación 1 o la preparación de celulasa según la reivindicación 14.

16. Método para reducir la velocidad a la que el tejido que contiene celulosa adquiere pelusas o para reducir las pelusas en tejidos que contienen celulosa, el cual comprende una etapa que consiste en poner en contacto el tejido que contiene celulosa con la proteína según la reivindicación 1 o la preparación de celulasa según la reivindicación 14.

17. Método para tratar la pérdida de peso de tejidos que contienen celulosa para mejorar su tacto y su aspecto, el cual comprende una etapa que consiste en poner en contacto el tejido que contiene celulosa con la proteína según la reivindicación 1 o la preparación de celulasa según la reivindicación 14.

18. Método para proporcionar la clarificación del color de tejidos coloreados que contienen celulosa, el cual comprende una etapa que consiste en tratar los tejidos coloreados que contienen celulosa con la proteína según la reivindicación 1 o la preparación de celulasa según la reivindicación 14.

19. Método para proporcionar una variación localizada en el color de tejidos coloreados que contienen celulosa, el cual comprende una etapa que consiste en tratar los tejidos coloreados que contienen celulosa con la proteína según la reivindicación 1 o la preparación de celulasa según la reivindicación 14.

20. Método para reducir la velocidad a la que los tejidos que contienen celulosa se vuelven rígidos o para reducir la rigidez en tejidos que contienen celulosa, el cual comprende una etapa que consiste en tratar los tejidos que contienen celulosa con la proteína según la reivindicación 1 o la preparación de celulasa según la reivindicación 14.

21. Método según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 21, caracterizado porque el tratamiento de los tejidos se realiza por medio de remojo, lavado o enjuague de los tejidos.

22. Aditivo para detergente que comprende la proteína según la reivindicación 1 o la preparación de celulasa según la reivindicación 14 en una forma granular no dispersante o en una forma líquida estabilizada.

23. Composición detergente que comprende la proteína según la reivindicación 1 o la preparación de celulasa según la reivindicación 14.

24. Método para mejorar el refinado de una pulpa de papel, que comprende una etapa que consiste en tratar la pulpa de papel con la proteína según la reivindicación 1 o la preparación de celulasa según la reivindicación 14.

25. Método para el destintado de papel usado que comprende una etapa que consiste en el tratamiento del papel usado con la proteína según la reivindicación 1 o la preparación de celulasa según la reivindicación 14 en presencia de un agente de destinte.

26. Método para mejorar la digestibilidad de un alimento para animales, que comprende una etapa que consiste en el tratamiento de un alimento que contiene celulosa con la proteína según la reivindicación 1 o la preparación de celulasa según la reivindicación 14.