PROCEDIMIENTO PARA DETERMINAR LA CANTIDAD DE ADN CIRCULANTE EN PLASMA Y LA DETECCION DE CANCER.

Un procedimiento para determinar la concentración de ADN circulante total en plasma en una muestra de plasma de un paciente de cáncer,

un sujeto con susceptibilidad al cáncer o con riesgo de desarrollar cáncer, que comprende:

1) extraer el ADN de la muestra de plasma;

2) añadir a la reparación de ADN: a) una mezcla de cebadores oligonucleotídicos adecuados para la amplificación específica por PCR de un fragmento del gen de la telomerasa transcriptasa inversa humana (hTERT), y b) una sonda oligonucleotídica, que tiene al menos un inactivador y un fluoróforo indicador en los extremos 3'' y 5'', capaz de hibridar con una secuencia dentro de la región delimitada por los cebadores, en condiciones adecuadas para llevar a cabo una reacción de PCR,

3) añadir una ADN polimerasa termoestable con actividad exonucleasa 5''-3'' y amplificar el fragmento del gen hTERT;

4) medir la fluorescencia producida

Procedimiento para determinar la cantidad de ADN circulante en plasma y la detección de cáncer.

La presente invención proporciona un procedimiento in vitro para el diagnóstico precoz, pronóstico y monitorización de cáncer o para la determinación del riesgo de desarrollar cáncer. El procedimiento de la invención se basa en la cuantificación de ADN en una muestra de plasma mediante amplificación con PCR.

Técnica anterior

Un número de publicaciones científicas o de patente describe procedimientos para detectar cáncer basado en la identificación de alteraciones genéticas específicas de ADN o ARN circulante.

El documento US 5 496 699 desvela un procedimiento para detectar mutaciones en secuencias de ácido nucleico, en particular la secuencia del gen K-ras, en fluidos biológicos tales como sangre, suero o plasma.

El documento US 5 068 175 desvela un procedimiento para detectar la presencia de neoplasias malignas relacionadas con el oncogen ras en las que dicho gen se cuantifica en muestras de suero o plasma.

El documento WO01/42504 desvela la determinación de ácido nucleico extracelular, por ejemplo ADN de los genes K-ras y APC, en muestras de suero o plasma, para la evaluación del factor de riesgo relacionado con una serie de enfermedades neoplásicas.

El documento WO02/18652 desvela un procedimiento de detección cualitativa/cuantitativa de ARN telomerasa humana y ARN telomerasa transcriptasa inversa en plasma o suero para el diagnóstico, monitorización, tratamiento o evaluación de una serie de enfermedades neoplásicas.

En principio, los procedimientos para la caracterización molecular de alteraciones génicas tienen baja sensibilidad y requieren el análisis de un gran panel de marcadores génicos para obtener un nivel de información aceptable.

Recientemente se ha notificado un procedimiento para la cuantificación de ADN desnudo circulante en plasma en pacientes de cáncer de pulmón, basado en un ensayo colorimétrico capaz de discriminar entre pacientes y sujetos sanos, y de detectar la recidiva de la enfermedad durante el seguimiento (Sozzi, G. y col., Cancer Research 61, 4675-4678, Junio 15, 2001). No obstante, las técnicas colorimétricas (p. ej., tira reactiva para ADN) para la evaluación cuantitativa de ADN circulante están limitadas por una estrecha linealidad en el intervalo de 0,1-10 ng/ml y por una sensibilidad reducida a valores menores. Además, la lectura de la prueba depende de una evaluación subjetiva.

En un artículo más reciente (Hsueh-Wei Chang y col., Journal of the National Cancer Institute, Vol. 94, No. 22, 20 de noviembre de 2002) se ha sugerido en la análisis de la concentración de ADN en muestras de plasma y el análisis de SNP para la detección de una enfermedad neoplásica, en particular cáncer de ovario. La cuantificación del ADN se ha llevado a cabo mediante el análisis de la intensidad de la fluorescencia generada por el pigmento PicoGreen® unido a ADN bicatenario. Los resultados muestras que, al contrario que el análisis SNP, el procedimiento usado para medir la concentración de ADN en plasma es poco sensible y específico y, por tanto, no es adecuado para la detección selectiva de enfermedades neoplásicas en la población.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona un procedimiento para la determinación cuantitativa de ADN circulante total en una muestra de plasma de un paciente de cáncer, un sujeto susceptible de cáncer familiar o en riesgo de desarrollar cáncer, que comprende:

1) extraer el ADN de la muestra;

2) añadir a la preparación de ADN: a) una mezcla de cebadores oligonucleotídicos adecuados para la amplificación por PCR de un fragmento del gen de la telomerasa transcriptasa inversa humana (hTERT), y b) una sonda oligonucleotídica, que tiene al menos un inactivador y un fluoróforo indicador en los extremos 3' y 5', hibridando con una secuencia dentro de la región delimitada por los cebadores, en condiciones adecuadas para llevar a cabo una reacción de PCR,

3) añadir una ADN polimerasa termoestable con actividad exonucleasa 5'-3' y amplificar el fragmento del gen hTERT;

4) medir la fluorescencia producida.

La cantidad relativa de ADN presente en la muestra analizada puede obtenerse con facilidad mediante los valores de fluorescencia detectados mediante interpolación de una curva de calibración obtenida con cantidades conocidas de ADN.

De acuerdo con una forma de realización preferida, se diseñan cebadores y sondas para amplificar el fragmento 13059-13156 del gen hTERT (nº de acceso en GenBank AF128893).

El procedimiento descrito, conocido como PCR en tiempo real, puede realizarse automáticamente usando el aparato GeneAmp 5700 Detection System (Applied Biosystem), que proporciona una amplificación cuantitativa precisa de ADN mediante monitorización óptica continua de la reacción de PCR fluorogénica y puede cuantificar hasta un equivalente a 1 genoma, correspondiente a 6 pg de ADN genómico.

El procedimiento de cuantificación de ADN circulante de acuerdo con la invención se puede aplicar al diagnóstico precoz, pronóstico o monitorización clínica de pacientes con diferentes tipos de cáncer, incluidos los cánceres de colon-recto, cabeza-cuello, hígado y páncreas, particularmente cáncer de pulmón. El procedimiento de la invención también se puede usar para la determinación del riesgo o la probabilidad de desarrollar cáncer en sujetos sanos expuestos a factores de riesgo ambiental o del estilo de vida, tal como, en el caso del cáncer de pulmón, el tabaquismo. Un incremento en el ADN en plasma de estos sujetos es predictor de un aumento del riesgo y, por tanto, debería urgir a repetir la prueba con una muestra de plasma independiente, o a realizar investigaciones clínicas exhaustivas y específicas.

Descripción detallada de la invención

Se ha encontrado un procedimiento in vitro sencillo y preciso para la determinación de la presencia de una enfermedad neoplásica o para la evaluación del riesgo relacionado con el desarrollo de cáncer, mediante cuantificación de ADN en plasma usando la técnica de PCR en tiempo real. Más precisamente, la invención proporciona un procedimiento para la cuantificación de ADN circulante mediante monitorización óptica continua de una reacción de PCR fluorogénica llevada a cabo en una muestra de plasma, usando como cebadoras y sondas oligonucleótidos que se acoplan con el gen de la telomerasa transcriptasa inversa humana (hTERT). El índice de amplificación del hTERT se usa como una indicación de la cantidad total de ADN en la muestra analizada.

El procedimiento se ha validado en un estudio de casos y controles de tamaño grande (200 sujetos) con pacientes con cáncer de pulmón en estadio precoz, en los que se determinaron los niveles de ADN en plasma durante el seguimiento tras una resección del cáncer, y fumadores sanos de grandes cantidades con edad, sexo y hábitos de tabaquismo equivalentes. Los resultados del estudio muestran que 1) el procedimiento de la invención tiene elevadas especificidad y sensibilidad, como pone de manifiesto las curvas AUC y ROC (valor global: 0,94, intervalo 0,907-0,973) en pacientes, incluidos los que padecen cáncer en un estadio muy precoz (estadio IA), los valores de ADN circulante en plasma son aproximadamente 8 veces mayores que los encontrados en sujetos sanos, 3) en pacientes monitorizados durante el seguimiento de la resección del cáncer, los niveles de ADN disminuyen rápidamente hasta un valor similar al observado en sujetos sanos; en contraste con esto, se ha encontrado un incremento de hasta 20 veces en individuos con cáncer recurrente o metástasis.

Aunque la suma más elevada de la sensibilidad (90%), la especificidad (86%), valor predictor positivo (VPP-90%) y valor predictor negativo (PVN-90%) se obtuvo con un valor de concentración de ADN de 9 ng/ml, los intervalos de confianza (IC) alrededor de estos indicadores diagnósticos se superponen con los de las concentraciones adyacentes. Por tanto, la selección del punto de corte óptimo tendrá que tener en cuenta esta variabilidad. El valor de 25 ng/ml es el único punto de corte mostrado con sensibilidad que no se solapa con la de otros puntos de corte, aunque muestra una sensibilidad baja (46%, IC 95%, 36%, 56%).

La magnitud de OR (relaciones adversas) demuestra la fuerte asociación entre la concentración de ADN en plasma y el riesgo CPCNP, a pesar de los amplios límites de confianza. Nunca antes se habían notificado valores...

1. Un procedimiento para determinar la concentración de ADN circulante total en plasma en una muestra de plasma de un paciente de cáncer, un sujeto con susceptibilidad al cáncer o con riesgo de desarrollar cáncer, que comprende:

1) extraer el ADN de la muestra de plasma;

2) añadir a la reparación de ADN: a) una mezcla de cebadores oligonucleotídicos adecuados para la amplificación específica por PCR de un fragmento del gen de la telomerasa transcriptasa inversa humana (hTERT), y b) una sonda oligonucleotídica, que tiene al menos un inactivador y un fluoróforo indicador en los extremos 3' y 5', capaz de hibridar con una secuencia dentro de la región delimitada por los cebadores, en condiciones adecuadas para llevar a cabo una reacción de PCR,

3) añadir una ADN polimerasa termoestable con actividad exonucleasa 5'-3' y amplificar el fragmento del gen hTERT;

4) medir la fluorescencia producida.

2. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la concentración de ADN en la muestra de prueba se determina mediante interpolación de una curva de calibración calculada con cantidades conocidas de ADN.

3. Un procedimiento según las reivindicaciones 1-2, que además comprende comparar la concentración de ADN circulante con una concentración de referencia.

4. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 3, en el que la concentración de referencia es de 9 a 25 ng/ml.

5. Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicho fragmento del gen de la telomerasa transcriptasa inversa humana (hTERT) es de nt 13059 a nt 13156 de la secuencia en GenBank con número de acceso AF128893.

6. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5, en el que dicho fragmento del gen de la telomerasa transcriptasa inversa humana (hTERT) se amplifica usando las SEC IN Nº 1 y 2 como cebadores directo e inverso, respectivamente, y la SEC ID Nº 3 como la sonda.

7. Un procedimiento según las reivindicaciones 1-3, para el diagnóstico precoz, pronóstico o monitorización clínica de los pacientes de cáncer.

8. Un procedimiento según las reivindicaciones 1-3, para la evaluación del riesgo de desarrollar cáncer en individuos sanos o individuos con susceptibilidad familiar al cáncer.

9. Un procedimiento según la reivindicación 8, para la evaluación del riesgo de desarrollar cáncer en fumadores.

10. Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicho cáncer es cáncer de pulmón, de colon-recto, de cabeza y cuello, de hígado o de páncreas.

11. Un procedimiento según la reivindicación 10, en el que dicho cáncer es carcinoma de pulmón.