DETECCION ELECTROCATALITICA DE LA HIBRIDACION DE ACIDOS NUCLEICOS.

Un ensayo electrocatalítico de hibridación que comprende:

proporcionar una sonda de ácido nucleico inmovilizada sobre un soporte sólido;

poner en contacto la sonda de ácido nucleico con una muestra en donde la muestra comprende un ácido nucleico diana, un primer complejo de metal de transición y un segundo complejo de metal de transición; y

medir una señal electrocatalítica generada por hibridación de la sonda de ácido nucleico y la diana de ácido nucleico,

en donde la presencia del segundo complejo de metal de transición proporciona una señal electrocatalítica intensificada

Detección electrocatalítica de la hibridación de ácidos nucleicos.

Antecedentes

La aplicación de información genética disponible recientemente a los avances en medicina preventiva y tratamiento de enfermedades requiere tecnologías eficientes y exactas de detección de DNA.^1,2 Un foco de desarrollos tecnológicos recientes está representado por los sistemas que aprovechan la hibridación diferencial del DNA en superficies sólidas.^3-6 En teoría, la hibridación de secuencias diana que representan fragmentos genómicos microbianos o genes relacionados con enfermedades humanas a secuencias sonda inmovilizadas podría permitir la detección de DNA con sensibilidad y capacidad altas. Además, si pudieran discriminarse secuencias estrechamente relacionadas, podrían detectarse e identificarse patógenos microbianos.

Una diversidad de técnicas espectroscópicas y analíticas pueden utilizarse para detectar la hibridación de DNA en superficies.^7-22 Pueden utilizarse nanopartículas de oro modificadas con DNA para detectar secuencias de DNA utilizando espectroscopia óptica y de fluorescencia.^12,18 La resonancia de plasmones superficiales proporciona también un medio para monitorizar la hibridación de secuencias diana a sustratos de oro modificados con DNA en tiempo real.^3,4,19,20,22 Los resultados obtenidos con estos métodos indican que puede conseguirse detección de DNA con alta sensibilidad cuando se utilizan oligonucleótidos inmovilizados para capturar secuencias de una solución.

Otros métodos de detección de genes (v.g., Pat. U.S. No. 5.972.692, y Pat. U.S. No. 5.312.527) no utilizan un ensayo electrocatalítico para detectar la hibridación del DNA.

La detección de secuencias de DNA utilizando lectura electroquímica es particularmente atractiva para el desarrollo de diagnósticos clínicos.^2,6,23,24 Medidas electroquímicas cuantitativas de este tipo pueden hacerse utilizando instrumentación compacta y económica, y siendo típicamente innecesaria la marcación covalente de las muestras de DNA con grupos informadores, lo que simplifica el procedimiento de preparación de la muestra. De hecho, se han publicado varios métodos para la detección electroquímica de DNA, la mayor parte de los cuales están basados en la señal producida por un grupo informador con actividad rédox unido por enlaces no covalentes, que se incrementa cuando el DNA se hibrida a una superficie modificada con una secuencia sonda. Adicionalmente, sustituciones de una sola base que producen desapareamientos de bases en dúplex de DNA inmovilizados sobre superficies de oro pueden detectarse electroquímicamente utilizando sondas de intercalación.^14,16 La interrupción del apilamiento de bases causada por el desapareamiento atenúa el flujo de corriente al informador por interferir con el acoplamiento electrónico mediado por el DNA. Este efecto podría permitir en potencia la detección electroquímica de mutaciones puntuales relacionadas con enfermedades.

Los procesos electrocatalíticos que amplifican las señales obtenidas en las superficies de electrodos modificadas con DNA proporcionan un medio poderoso para aumentar la sensibilidad y exactitud de un ensayo de detección. Ru(bpy)₃³⁺ generado electroquímicamente reacciona con las guaninas contenidas en una diana hibridada en un proceso catalítico que genera grandes señales que pueden ser utilizadas para detectar la hibridación de DNA, aunque con limitaciones debido a dependencia de la secuencia.^13,15,21,24 Adicionalmente, una reacción electrocatalítica entre una sonda de intercalación, azul de metileno, y Fe(CN)₆^3- transportado en solución ha sido utilizada para amplificar los cambios de señal que informan de la presencia de mutaciones puntuales productoras de desapareamientos¹⁶. Se ha utilizado también ferrocianuro para reciclar una enzima y monitorizar la reducción química de o-quinona generada enzimáticamente.²⁸ Restos con actividad rédox fotoinducibles o químicamente inducibles unidos covalentemente a oligómeros de ácido nucleico han sido utilizados para detección de la hibridación de ácidos nucleicos²⁹. Sin embargo, ningún sistema es ideal para detección de secuencias estrechamente relacionadas basada en hibridación.

Sumario de la invención

La invención se refiere a un nuevo ensayo electrocatalítico de detección de ácido nucleico que informa de la hibridación de ácido nucleico entre una sonda de ácido nucleico y un ácido nucleico, o entre un primer ácido nucleico y un segundo ácido nucleico, y puede resolver cambios de una sola base en una secuencia de ácido nucleico diana. El método aprovecha una reacción entre un par rédox que comprende un compuesto de fijación de ácido nucleico y una sonda con actividad rédox. El compuesto de fijación de ácido nucleico comprende un compuesto con actividad rédox que puede fijarse al ácido nucleico electrostáticamente y puede reducirse a potencial bajo. Este compuesto se fija al ácido nucleico, produciendo un complejo combinado electrostáticamente. La señal generada por la fijación puede amplificarse por el uso de una sonda con actividad rédox que puede oxidar de nuevo el complejo combinado electrostáticamente.

El compuesto de fijación de ácido nucleico puede ser un complejo de un metal de transición. Con preferencia, el metal de transición es uno seleccionado del grupo constituido por cobalto, hierro, molibdeno, osmio, rutenio y renio. También preferiblemente, el complejo de metal de transición es un complejo de amonio del metal de transición. Más preferiblemente, el complejo de metal de transición es Ru(NH₃)₆³⁺. La sonda con actividad rédox puede ser también un complejo de metal de transición. Con preferencia, el metal de transición es uno seleccionado del grupo constituido por cobalto, molibdeno, osmio, hierro y renio. También preferiblemente, el complejo de metal de transición es un complejo de cianato (sic) del metal de transición. Más preferiblemente, el complejo de metal de transición es Fe(CN)₆^3-.

El compuesto de fijación de ácido nucleico se fija al ácido nucleico principalmente por interacciones electrostáticas con la cadena principal de fosfato, y por consiguiente su reducción electroquímica produce una señal que informa del aumento de grupos cargados negativamente en la superficie del electrodo como resultado de la hibridación de un ácido nucleico diana. La señal es amplificada por el oxidante de metal de transición de la sonda con actividad rédox que permite que el metal de transición se regenere para ciclos múltiples. La inmovilización de la sonda de ácido nucleico en superficies altamente conductoras, v.g., oro, amplifica los efectos cinéticos de los desapareamientos de bases sobre la hibridación del ácido nucleico, permitiendo resolver cambios de una sola base.

El ensayo de la presente invención puede utilizarse para detectar genes de patógenos, tales como bacterias o virus, o puede utilizarse para detectar la expresión de genes en un individuo.

Con preferencia, el método se utiliza para detectar la hibridación entre dos moléculas de ácido nucleico. La invención incluye también un método para detectar la hibridación entre dos moléculas de DNA o RNA, o entre moléculas de DNA y RNA.

La invención presenta un método para detectar la hibridación de ácido nucleico entre una sonda de ácido nucleico y un ácido nucleico diana en una muestra, donde el método incluye los pasos de: (a) proporcionar una sonda de ácido nucleico inmovilizada sobre un sustrato sólido; (b) poner en contacto, en condiciones de hibridación, el soporte sólido y la sonda inmovilizada con una solución que contiene la muestra y un par rédox, en donde el par rédox comprende un primer complejo de metal de transición y un segundo complejo de metal de transición; y (c) medir la señal electrocatalítica generada por hibridación de la sonda de ácido nucleico y el ácido nucleico diana; donde un aumento de la señal detectada en el paso (c) con relación a la de una muestra de control que no contiene ácido nucleico alguno, indica que ha ocurrido hibridación del ácido nucleico. El método puede incluir también un paso adicional de testar un control, poniendo en contacto, en condiciones de hibridación, el soporte sólido y la sonda de ácido nucleico inmovilizada con una solución que no contiene muestra alguna, y un par rédox que comprende un primer complejo de metal de transición y un segundo complejo de metal de...

1. Un ensayo electrocatalítico de hibridación que comprende:

proporcionar una sonda de ácido nucleico inmovilizada sobre un soporte sólido;

poner en contacto la sonda de ácido nucleico con una muestra en donde la muestra comprende un ácido nucleico diana, un primer complejo de metal de transición y un segundo complejo de metal de transición; y

medir una señal electrocatalítica generada por hibridación de la sonda de ácido nucleico y la diana de ácido nucleico,

en donde la presencia del segundo complejo de metal de transición proporciona una señal electrocatalítica intensificada.

2. El ensayo electrocatalítico de hibridación de la reivindicación 1, en donde el primer complejo de metal de transición comprende un metal seleccionado del grupo constituido por cobalto, hierro, molibdeno, osmio, rutenio y renio.

3. El ensayo electrocatalítico de hibridación de la reivindicación 2, en donde el segundo complejo de metal de transición comprende un metal seleccionado del grupo constituido por hierro, cobalto, molibdeno, osmio y renio.

4. El ensayo electrocatalítico de hibridación de la reivindicación 1, en donde el primer complejo de metal de transición es un complejo de metal de transición con amonio.

5. El ensayo electrocatalítico de hibridación de la reivindicación 4, en donde el segundo complejo de metal de transición es un complejo de metal de transición y ciano.

6. El ensayo electrocatalítico de hibridación de la reivindicación 1, en donde el soporte sólido comprende oro.

7. El ensayo electrocatalítico de hibridación de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente comparar la señal electrocatalítica medida con un control.

8. Un método para detectar la hibridación entre una sonda de ácido nucleico y un ácido nucleico diana, que comprende:

proporcionar una sonda de ácido nucleico inmovilizada sobre un soporte sólido;

poner en contacto la sonda de ácido nucleico con una muestra en donde la muestra comprende un ácido nucleico diana, un primer complejo de metal de transición y un segundo complejo de metal de transición; y

medir una señal electrocatalítica generada por hibridación de la sonda de ácido nucleico y la diana de ácido nucleico.

9. El método de la reivindicación 8, que comprende adicionalmente:

comparar la señal electrocatalítica medida con un control.

10. El método de la reivindicación 8, en el cual el primer complejo de metal de transición comprende un metal seleccionado del grupo constituido por cobalto, hierro, molibdeno, osmio, rutenio y renio.

11. El método de la reivindicación 10, en el cual el segundo complejo de metal de transición comprende un metal seleccionado del grupo constituido por hierro, cobalto, molibdeno, osmio y renio.

12. El método de la reivindicación 8, en donde el primer complejo de metal de transición es un complejo de metal de transición con amonio.

13. El método de la reivindicación 12, en donde el segundo complejo de metal de transición es un complejo de metal de transición con ciano.

14. El método de la reivindicación 8 en donde el sustrato conductor comprende oro.

15. El método de la reivindicación 8, en donde el ácido nucleico diana es RNA.

16. Un método para detectar la hibridación entre una sonda de ácido nucleico y un ácido nucleico diana, que comprende:

proporcionar una sonda de ácido nucleico inmovilizada sobre un soporte sólido;

poner en contacto la sonda de ácido nucleico con una muestra en donde la muestra comprende un ácido nucleico diana, un primer complejo de metal de transición y un segundo complejo de metal de transición en donde el primer complejo de metal de transición es un complejo de Ru(NH₃)₆^3-; y el segundo complejo de metal de transición es un complejo de Fe(CN)₆^3-; y

medir una señal electrocatalítica generada por hibridación de la sonda de ácido nucleico y la diana de ácido nucleico.

17. El método de la reivindicación 16, que comprende adicionalmente:

comparar la señal electrocatalítica medida con un control.

18. El método de la reivindicación 16, en donde el sustrato conductor comprende oro.

19. El método de la reivindicación 16, en donde el ácido nucleico diana es RNA.

20. El método de la reivindicación 16, en donde el ácido nucleico diana es DNA.