Un procedimiento para la cuantificación de la cantidad absoluta de alérgeno en una muestra de alérgeno,

en el que el alérgeno consiste en más de un isoalérgeno o isoalérgenos de alérgeno o alérgenos homólogos que comprende las siguientes etapas:

a) proporcionar una cantidad conocida de uno o más péptido o péptidos patrón de calibración de alérgeno que tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica a una secuencia a encontrar dentro del alérgeno a cuantificar mediante la identificación de una secuencia constante de aminoácidos dentro del alérgeno a cuantificar mediante la comparación de secuencias de aminoácidos de isoalérgenos o alérgenos homólogos y la preparación de un péptido patrón de calibración de alérgenos sintético que tiene esta secuencia constante y el marcaje de dicho péptido o péptidos patrones de calibración de alérgenos mediante la introducción de funcionalidades de modificación de masa,

b) la degradación de la muestra de alérgeno para obtener una mezcla de péptidos y opcionalmente el marcaje de dichos péptidos con uno o más agente o agentes marcadores mediante la introducción de funcionalidades de modificación de masa, en la que si ambos péptidos en la muestra de alérgeno degradada y el péptido o los péptidos patrón de calibración de alérgenos se marcan, el agente o agentes marcadores usados para el marcaje del péptido o péptidos patrón de calibración de alérgenos son diferentes del agente o agentes marcadores usados para marcar los péptidos de la muestra de alérgeno degradada,

c) la cuantificación de la cantidad absoluta de alérgeno mediante la correlación de la cantidad de péptido o péptidos patrón de calibración de alérgeno con la cantidad del péptido o péptidos correspondientes de la muestra de alérgeno degradado mediante espectrometría de masas

Procedimiento de cuantificación de alérgenos.

Campo técnico

La presente invención se refiere al campo de la cuantificación de alérgenos.

Antecedentes de la invención

Los alérgenos son moléculas antigénicas que inducen respuestas alérgicas y la producción de anticuerpos IgE en seres humanos. Se usan tanto para diagnóstico como para tratamiento de alergias, es decir, inmunoterapia alérgena, esto último en forma de vacunas alérgenas. Los materiales básicos alergénicos a los que se exponen los seres humanos, tales como alimentos, pólenes o partículas fecales de ácaros aparecen de forma natural como mezcla o mezclas complejas de alérgenos mayores y menores. Los alérgenos mayores son alérgenos a los que una mayoría de pacientes, que son alérgicos a la fuente, reaccionan. Parece, sin embargo, que cualquier proteína es un alérgeno potencial, puesto que todavía se identifican más y más alérgenos menores a medida que aumenta el conocimiento.

Debido a la complejidad de las fuentes alérgenas, las secuencias de aminoácidos de varios alérgenos se dedujeron primero a partir de secuencias de nucleótidos derivadas de ADNc. La clonación de genes que codifican alérgenos reveló que la mayoría de los alérgenos son heterogéneos y que aparecen como mezclas de isoalérgenos y variantes. El alineamiento de secuencias de aminoácidos de isoalérgenos y alérgenos homólogos demostró que pueden identificarse mediante y/o dividirse en secuencias de región constante y variable. Las secuencias de aminoácidos de región constante son específicas de la especie, sin embargo las secuencias de aminoácidos de región variable son específicas de cada uno de los isoalérgenos.

La inmunoterapia y el diagnóstico específicos de alérgenos convencionales se realizan actualmente mediante el uso de extractos de alérgenos naturales normalizados que se formulan adicionalmente en vacunas alérgenas. Estas vacunas acuosas se basan en materiales básicos naturales alérgenos, tales como polen de árboles y hierba, cultivos de ácaros del polvo y partículas de pelo y escamas de piel animales. La composición de estos materiales básicos naturales se sabe que varía considerablemente dependiendo del tiempo y lugar de recogida de los materiales básicos alérgenos. Las vacunas alérgenas comerciales pueden adicionalmente formularse en mezclas de alérgenos usando diversas especies.

El conocimiento de la composición de los extractos y el contenido de los alérgenos esenciales es un prerrequisito para la reproducibilidad, seguridad y eficacia del producto final. Un reto principal en la fabricación de vacunas alérgenas es la normalización, es decir, asegurar una potencia constante de un lote a otro. Puesto que la materia prima que se produce de manera natural, la variación es considerable y necesita controlarse mediante medidas de base científica. La composición del extracto idealmente debería reflejar la composición de los componentes solubles en agua del material básico alérgeno ya que se extrae de la superficie de la mucosa de las vías respiratorias y se presenta al sistema inmune humano. Todos los extractos, sin embargo, contienen varios alérgenos que contribuyen a la unión de IgE total en diferentes combinaciones para pacientes individuales. Idealmente, por lo tanto, todos los componentes deben controlarse tanto cualitativamente como cuantitativamente, pero con lo tecnología actual esto no es prácticamente posible.

La normalización se realiza actualmente de muchas formas diferentes, puesto que cada fabricante tiene procedimientos de normalización específicos de la compañía. La normalización se realiza mediante técnicas tales como SDS-PAGE, isoelectroenfoque además de una diversidad de técnicas inmunoelectroforéticas (QIE) y ELISA usando anticuerpos mono- y/o policlonales y radio alergosorbentes (RAST) o técnicas relacionadas. Una normalización de lote a lote óptima, tal como el procedimiento de estandarización SQ, es esencialmente un procedimiento de tres etapas: 1) asegurar una composición óptima y relaciones constantes entre todos los componentes mediante técnicas semicuantitativas inmunoelectroforéticas, 2) determinar los componentes alérgenos principales mediante inmunoelectroforesis cuantitativa, y 3) ajustar la potencia de unión a IgE global como se determinó en ensayos con Magic Lite®. En Europa, toda la normalización se realiza actualmente en relación con una preparación de referencia específica de compañía de uso interno, mientras que en Estados Unidos, la FDA emite patrones que deben usarse por todos los fabricantes. Todos los aspectos cuantitativos de estas técnicas usadas en la actualidad dependen de los anticuerpos como reactivos y como tales son vulnerables al cambio a lo largo del tiempo.

La cuantificación absoluta de los componentes de vacuna específicos en mezclas complejas de alérgenos no es sencilla y no se ha establecido todavía como una técnica sensible, rutinaria de alto rendimiento.

También en la industria alimentaria las técnicas rutinarias de alto rendimiento para la cuantificación y detección fiable de alérgenos alimentarios es necesaria. Pueden encontrarse frutos secos como una parte oculta de un alimento debido a contaminación cruzada accidental durante la fabricación. Las compañías que producen alimentos similares con y sin por ejemplo frutos secos pueden tener dificultades en la limpieza del equipamiento de producción entre las fabricaciones de los diferentes tipos de alimentos. Pueden permanecer trazas de alimentos previamente producidos tales como frutos secos en el equipamiento. Los primeros lotes de alimentos fabricados sin frutos secos que pasan a través del mismo equipo contendrán probablemente trazas de frutos secos. Los alimentos que pueden causar reacción alérgica debido a contaminación cruzada de frutos secos o cacahuetes son por ejemplo chocolate, caramelos, galletas, postres, dulces, rosquillas, cereales, batidos, barras de granola, muesli, tartas, magdalenas, helado, salsa barbacoa. La leche de vaca puede causar una reacción alérgica a pequeñas cantidades de proteína láctea de productos lácteos, a partir de leche de vaca, fórmula basada en leche de vaca o alimentos infantiles que contienen proteína láctea. Para evitar la contaminación de proteína láctea durante la producción de alimentos infantiles o fórmula infantil a niños alérgicos a la leche se necesita por lo tanto un procedimiento de detección y cuantificación de alérgenos lácteos. Son necesarios procedimientos de detección y cuantificación fiables para alérgenos alimentarios con el fin de asegurar el cumplimiento del etiquetado alimentario y mejorar la protección del consumidor. Se han descrito procedimientos fisicoquímicos por ejemplo espectrometría de masas, así como procedimientos inmunológicos. Los criterios usuales de sensibilidad, especificidad, reproducibilidad, precisión y exactitud deben cumplirse. Aun así, los problemas de reactividad cruzada persisten, de efectos matriz y de procesamiento de alimentos. La actividad biológica puede permanecer cuando la proteína se ha desnaturalizado.

La espectrometría de masas biológica (EM) se empleó por primera vez para evaluar el peso molecular y la identidad de proteínas y péptidos. En los últimos años, los avances en la espectrometría de masas han dado como resultado técnicas que pueden usarse para la cuantificación de una diversidad de biomoléculas a partir de mezclas complejas tales como muestras plasmáticas, celulares y tisulares. Las técnicas de cuantificación anteriores han establecido solamente la cuantificación relativa de proteínas mientras que las técnicas más recientes evalúan las cantidades absolutas de moléculas de interés. El rápido desarrollo de las técnicas de cuantificación se debe principalmente al progreso en el campo de la proteómica, particularmente en aplicaciones que distinguen, por ejemplo, estados sanos y enfermos y la identificación de moléculas marcadoras para diversas enfermedades tales como cáncer, artritis reumatoide y enfermedad de Alzheimer. La principal ventaja de estas técnicas de cuantificación mediante EM es la alta sensibilidad de las técnicas que varía desde 300 amol a 300 fmol de las muestras.

El documento WO 2004/070352 desvela un procedimiento para la cuantificación de péptidos en relación con un patrón interno que usa reactivos de marcaje isobárico o conjuntos de reactivos de marcaje isobárico.

El documento US 6.872.575 desvela un procedimiento para la identificación de una o más proteínas en mezclas de muestras complejas sin purificar la proteína y obtener su identificación peptídica compuesta.