Un procedimiento para medir la actividad inmunológica de una preparación de vacuna en forma de una mezcla de una o más enzimas alergénicas e hidróxido de aluminio,

en el que la mezcla comprende una fase líquida y una fase sólida, y en el que al menos una parte de la(s) enzima(s) alergénica(s) se adsorbe en la fase sólida, procedimiento que comprende las etapas de medir la actividad enzimática de la mezcla y/o medir la actividad enzimática de la enzima alergénica en la fase líquida tras una separación de la fase líquida de la fase sólida, y/o medir la actividad enzimática de la enzima alergénica en la fase sólida tras una separación de la fase líquida de la fase sólida, en un ensayo de actividad enzimática, y usar la medición obtenida como una indicación de la actividad inmunológica de la preparación de vacuna

La presente invención se refiere a un procedimiento in vitro para medir la actividad enzimática de una o más enzimas alergénicas en una preparación de vacuna y así obtener una indicación de la actividad inmunológica y/o una cuantificación de la cantidad de enzima alergénica en la preparación de vacuna.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La interacción de proteínas con superficies es un fenómeno ampliamente reconocido de importancia tanto fisiológica como tecnológica. Un ejemplo importante es la adsorción de alérgenos de proteína al adyuvante hidróxido de aluminio en vacunas para la alergia. Un adyuvante es un compuesto que actúa potenciando la respuesta inmunitaria tras la vacunación. El efecto del adyuvante de hidróxido de aluminio se ha investigado mucho y se han propuesto numerosas teorías en lo referente al mecanismo.

Las vacunas para la alergia para, por ejemplo, inyección subcutánea pueden prepararse mezclando una disolución acuosa de un alérgeno y un vehículo de fase sólida, por ejemplo, gel de hidróxido de aluminio, para producir una mezcla en la que al menos una parte del alérgeno se adsorbe en la fase sólida y parte de o nada del alérgeno está en la fase líquida. El vehículo de fase sólida pude servir de adyuvante, es decir, potencia la respuesta inmunitaria del alérgeno, aunque el mecanismo de la potenciación no siempre se entiende completamente. Igualmente, el mecanismo y la naturaleza de la adsorción del alérgeno en el vehículo de fase sólida no siempre se entienden completamente y puede depender plenamente del tipo de alérgeno implicado. Teóricamente, sin embargo, la adsorción en los geles de hidróxido de aluminio implica parcialmente fuerzas electrostáticas. Para las proteínas, se cree que los grupos fosfato de proteínas fosforiladas también interactúan con el gel de hidróxido de aluminio y posiblemente sustituye hasta cierto punto los grupos hidróxido en la estructura del gel.

La capacidad de adsorción de proteínas del hidróxido de aluminio se ha estudiado profundamente con las proteínas modelo ovoalbúmina (OA) y albúmina de suero bovino (BSA). Recientemente se han llevado a cabo estudios referentes al impacto estructural de la adsorción de proteína en hidróxido de aluminio. Las mediciones de fluorescencia de emisión junto con calorimetría diferencial de barrido indican que se producen alteraciones estructurales importantes tras la adsorción de OA y BSA en hidróxido de aluminio (Jones y col., Effects of Adsorption to Aluminium Salt Adjuvants on the Structure and Stability of Model Protein Antigens, The Journal of Biological Chemistry, vol. 280, pág. 13406-13414, 2005). Otro estudio indica por el contario que la presencia de hidróxido de aluminio en un experimento de ELISA ayudó a mantener la OA en la conformación nativa (Houen y col., A Non-denaturing Enzyme Linked Immunosorbent Assay With Protein Preadsorbed Onto Aluminium Hydroxide, Journal of Immunological Methods, vol. 200, pág.

99-105, 1997). La OA adsorbida en hidróxido de aluminio antes de la transferencia a la superficie de plástico del pocillo de una placa de microvaloración mantuvo su capacidad para unirse a anticuerpos monoclonales producidos contra la forma nativa de OA. Por el contrario, la OA no se preincubó con hidróxido de aluminio unido a anticuerpos monoclonales producidos contra albúmina desnaturalizada con calor. Sin embargo, estas técnicas no facilitan información sobre proteínas individuales presentes en una mezcla de proteínas.

El efecto del hidróxido de aluminio sobre la estructura y la estabilidad de alérgenos es importante desde varias perspectivas. Los epítopos conformacionales pueden perderse durante la adsorción y la inmunogenicidad puede alterarse como consecuencia del almacenamiento durante un periodo de tiempo más largo.

El grado de adsorción varía con la naturaleza del alérgeno específico en cuestión. En el caso de un alérgeno en forma de un extracto de un material biológico, por ejemplo, un extracto de alérgenos de polen de césped, el extracto contiene varios iones y moléculas diferentes que posiblemente interfieren con la unión de los alérgenos al vehículo de fase sólida.

El ácaro del polvo doméstico (HDM) Dermatophagoides pteronyssinus es una fuente importante de alérgenos inhalados. Los alérgenos de proteína Der p 1 y Der p 2 se consideran los dos alérgenos más potentes de los alérgenos Der p. Se ha caracterizado bien la estructura y la actividad enzimática de Der p 1. Varios estudios in vitro sugieren que la actividad de cisteínaproteasa de Der p 1 intensifica la potencia del alérgeno, por ejemplo, escindiendo proteínas de la zona de oclusión en las células epiteliales del pulmón y escindiendo CD23 (receptor de IgE de baja afinidad) en células B humanas (Jacquet y col., Biochemical and Immunological Characterization of a Recombinant Precursor form of the House Dust Mite Allergen Der p 1 produced by Drosophila cells, Clinical and Experimental Allergy, vol. 30, pág. 784-793, 2000). Las vacunas contra HDM basadas en el adyuvante de hidróxido de aluminio contienen extracto de HDM purificado como principio activo farmacéutico (PAF).

La actividad alergénica y la posibilidad de inducir reacciones alérgicas puede ensayarse, por ejemplo, por inyección intradérmica en animales sensibilizados y por medición del cambio de diversos síntomas (Kildsgaard y col., Assessment of the in vivo allergenic potency of new allergy vaccines by intradermal testing in sensitised mice, Clinical Immunology and Allergy en Medicine, Proceedings of the 21st EAACI Congress 2002, Nápoles, Italia). Sin embargo, tales procedimientos in vivo son laboriosos y requieren tiempo y necesitan el uso de animales de prueba, que no se desea.

Hasta ahora ha sido una práctica común evaluar la actividad inmunológica de una vacuna in vitro basándose en una medición de la actividad inmunológica de la disolución de alérgeno usada para la preparación de la vacuna de vehículo de fase sólida lista para uso.

El documento WO2005/022157 desvela un procedimiento in vitro para evaluar la actividad inmunológica de una preparación de vacuna en forma de una mezcla de un antígeno molecular y un vehículo, en el que la mezcla comprende una fase líquida y una fase sólida a la que al menos una parte del antígeno está unida, procedimiento que comprende las etapas de i) someter la vacuna a una medición de la actividad inmunológica seleccionada del grupo que está constituido por a) capacidad de unión a anticuerpo usando un inmunoensayo que emplea un anticuerpo específico de antígeno unido a una fase sólida de anticuerpo, b) capacidad para activar células efectoras y c) posibilidad de inducir anafilaxia; y ii) usar los resultados de medición para evaluar la actividad inmunológica de la vacuna. El documento WO2005/022157 no desvela la medición de la actividad enzimática en un producto que contiene hidróxido de aluminio como adyuvante y no desvela el uso de la actividad enzimática medida para evaluar la actividad inmunológica de la vacuna.

La naturaleza de la adsorción de alérgenos a adyuvantes de hidróxido de aluminio es muy compleja y ampliamente desconocida y también se espera que varíe entre diferentes alérgenos. El objeto de la presente invención es proporcionar un nuevo procedimiento in vitro para evaluar y cuantificar la actividad inmunológica de preparaciones de vacunas para la alergia basadas en adyuvantes de hidróxido de aluminio tales como vacunas listas para uso. RESUMEN DE LA INVENCIÓN

Según un aspecto de la invención se proporciona un procedimiento para medir la actividad inmunológica de una preparación de vacuna en forma de una mezcla de una o más enzimas alergénicas e hidróxido de aluminio, en el que la mezcla comprende una fase líquida y una fase sólida, y en el que al menos una parte de la(s) enzima(s) alergénica(s) se adsorbe a la fase sólida, procedimiento que comprende las etapas para medir la actividad enzimática de la mezcla y/o medir la actividad enzimática de la enzima alergénica en la fase líquida tras una separación de la fase líquida de la fase sólida, y/o medir la actividad enzimática de la enzima alergénica en la fase sólida tras una separación de la fase líquida de la fase sólida, en un ensayo de actividad enzimática, y usar la medición obtenida como una indicación de la actividad inmunológica de la preparación de vacuna.

Según otro aspecto de la invención se proporciona un procedimiento para la cuantificación de la cantidad de enzima alergénica en una preparación de vacuna en forma de una...

1. Un procedimiento para medir la actividad inmunológica de una preparación de vacuna en forma de una mezcla de una o más enzimas alergénicas e hidróxido de aluminio, en el que la mezcla comprende una fase líquida y una fase sólida, y en el que al menos una parte de la(s) enzima(s) alergénica(s) se adsorbe en la fase sólida, procedimiento que comprende las etapas de medir la actividad enzimática de la mezcla y/o medir la actividad enzimática de la enzima alergénica en la fase líquida tras una separación de la fase líquida de la fase sólida, y/o medir la actividad enzimática de la enzima alergénica en la fase sólida tras una separación de la fase líquida de la fase sólida, en un ensayo de actividad enzimática, y usar la medición obtenida como una indicación de la actividad inmunológica de la preparación de vacuna.

2. Un procedimiento para la cuantificación de la cantidad de enzima alergénica en una preparación de vacuna en forma de una mezcla de una o más enzimas alergénicas e hidróxido de aluminio, en el que la mezcla comprende una fase sólida y una fase líquida, y en el que al menos una parte de la(s) enzima(s) alergénica(s) se adsorbe a la fase sólida, procedimiento que comprende las etapas de medir la actividad enzimática de la mezcla y/o medir la actividad enzimática de la enzima alergénica en la fase líquida tras una separación de la fase líquida de la fase sólida, y/o medir la actividad enzimática de la enzima alergénica en la fase sólida tras una separación de la fase líquida de la fase sólida, en un ensayo de actividad enzimática, y usar la medición obtenida para cuantificar la cantidad de enzima alergénica.

3. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en el que se usa un sustrato específico para una enzima alergénica para medir la actividad enzimática de la enzima alergénica.

4. El procedimiento según la reivindicación 3, en el que se usa un inhibidor para inhibir una o más de la(s) enzima(s) alergénica(s) en la preparación de vacuna.

5. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1-2 y 4, en el que la(s) enzima(s) alergénica(s) está(n) en forma de un extracto.

6. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que al menos una de las enzimas alergénicas es una cisteína-proteasa.

7. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que al menos una de las enzimas alergénicas es una serina-proteasa.

8. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que la(s) enzima(s) alergénica(s) es (son) una o más seleccionadas del grupo que está constituido por Der p 1, Der p 3, Der p 6 y Der p 9.

9. El procedimiento según la reivindicación 8, en el que la enzima alergénica es Der p 1.

10. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6 y 8-9, en el que el sustrato usado es Z-LeuLeuGlu-MCA. 11. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1-2, en el que el ensayo de actividad enzimática es un ensayo de absorbancia, ensayo de fluorescencia, FTIR o un 5 procedimiento inmunológico. 12. El procedimiento según la reivindicación 11, en el que la ensayo de actividad enzimática es un ELISA. 13. El procedimiento según la reivindicación 11, en el que la ensayo de actividad enzimática es un ensayo de fluorescencia.

10 14. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en el que la preparación de vacuna se somete tanto a una medición de la actividad enzimática de la mezcla de la fase líquida y la fase sólida (medición 1) como a una medición de la actividad enzimática de la enzima alergénica en la fase líquida (medición 2), o se somete tanto a una medición de la actividad enzimática de la enzima alergénica en la fase líquida (medición 2) como a una medición

15 de la actividad enzimática de la enzima alergénica en la fase sólida (medición 3). 15. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en el que la preparación de vacuna se somete únicamente a una medición de la actividad enzimática de la enzima alergénica en la fase sólida tras una separación de la fase líquida de la fase sólida (medición 3).