CONTROL DE CRECIMIENTO Y REPARACION DE TEJIDOS GASTROINTESTINALES POR GASTROQUINAS.

Una composición farmacéutica usada para el tratamiento de un trastorno gastrointestinal,

comprendiendo dicha composición un péptido estimulador del crecimiento; estando seleccionado dicho péptido estimulador del crecimiento entre el grupo constituido por las secuencias de aminoácidos KKLQGKGPGGPPPK, LDALVKEKKLQGKGPGGPP PK, y LDALVKEKKLQGKGPGGPPPKGLMY

Control de crecimiento y reparación de tejidos gastrointestinales por gastroquinas.

Se caracteriza un nuevo grupo de Proteínas de la Mucosa del Antro Gástrico que son gastroquinas. Un miembro del grupo de gastroquinas se denomina AMP-18, se secuencian moléculas de ADN genómico y ADNc de AMP-18 para el ser humano y el ratón, y se predicen las secuencias proteicas a partir de las secuencias de nucleótidos. La molécula de ADNc para AMP-18 de cerdo se secuencia y se confirma por secuenciación parcial de la proteína natural. La proteína AMP-18 y péptidos activos derivados de su secuencia son factores de crecimiento celular. Sorprendentemente, péptidos capaces de inhibir los efectos de la proteína completa, también derivan de la secuencia proteica de AMP-18. El control del crecimiento de tejidos gastrointestinales de mamífero y su reparación está facilitado por el uso de la proteína o péptidos, haciendo de la proteína y los péptidos derivados candidatos para terapias.

Búsquedas de factores que afecten al tracto gastrointestinal (GI) de mamíferos están motivadas por la necesidad de agentes de diagnóstico y terapéuticos. Una proteína puede quedar como parte de la capa de mucina, proporcionando protección mecánica (por ejemplo, lubricante o estabilizador de gel) y química (por ejemplo, contra el ácido estomacal, quizá ayudando a mantener el gradiente de pH del moco y/o la barrera hidrófoba) a los tejidos subyacentes. Se ha sugerido que la familia de péptidos trébol tiene tales tareas citoprotectoras generales (véase Sands y Podolsky, 1996). Como alternativa, una actividad tipo citoquina podría ayudar a restaurar los epitelios dañados. Una sugerencia de que los péptidos trébol pueden actuar conjuntamente con otros factores para mantener y reparar el epitelio, subraya adicionalmente la complejidad de las interacciones que tienen lugar en el tracto gastrointestinal (Podolsky, 1997). El mantenimiento de la integridad del epitelio GI es esencial para el bienestar continuado de un mamífero, y el cierre de heridas después de una lesión sucede normalmente muy rápidamente (Lacy, 1988), seguido de la proliferación y diferenciación poco después para restablecer la integridad epitelial (Nursat y col., 1992). Por tanto, la protección y la restitución son dos características críticas de un tracto gastrointestinal sano, y pueden ser importantes en el entorno extracelular relativamente riguroso del estómago.

Búsquedas de proteínas GI han encontrado algo de éxito. Se describieron secuencias de ADN complementario (ADNc) a ARN mensajeros (ARNm) aislados de células estomacales humanas y porcinas en la University of Chicago Ph.D. tesis "Characterization of a novel messenger RNA and immunochemical detection of its protein from porcine gastric mucosa", diciembre de 1987, por uno de los presentes inventores trabajando con los otros inventores. Sin embargo, había varios errores de secuenciación del ADNc que condujeron a cambios aminoacídicos significativos a partir de la proteína AMP-18 descrita en este documento. La propia proteína se aisló y se purificó solamente como un aspecto de la presente invención, y se realizaron análisis funcionales para determinar su utilidad. Se buscaban las secuencias de ácido nucleico.

El documento EP-A1 0 972 830 describe un procedimiento para detectar una célula cancerosa caracterizado porque se detecta una producto de expresión de un gen capaz de cambiar el nivel de expresión del mismo debido a la canceración.

La invención se refiere a composiciones y usos como se define en las reivindicaciones adjuntas.

Un producto génico denominado Proteína de la Mucosa del Antro 18 ("AMP-18") es una gastroquina. La proteína se descubrió en células de la mucosa del antro estomacal por análisis de clones de ADNc obtenidos de seres humanos, cerdos, y ratones. La proteína es un miembro de un grupo de factores de crecimiento celular o citoquinas, más específicamente gastroquinas. Las secuencias de ADNc de AMP-18 predicen una proteína de 185 aminoácidos de longitud tanto para el cerdo como para el hombre. Las secuencias de nucleótidos también predicen una secuencia señal N-terminal de 20 aminoácidos para proteínas secretadas. La escisión del péptido N-terminal del precursor (preAMP-18) se confirmó para la proteína de cerdo; esta escisión produce una proteína secretada de 165 aminoácidos de longitud y aproximadamente 18.000 Dalton (18 kD) de tamaño. También se obtuvieron y secuenciaron las secuencias de ADN genómico humanas y de ratón. Se aisló un ADN genómico humano en 4 fragmentos solapantes de tamaños de 1,6 kb, 3 kb, 3,3 kb y 1,1 kb respectivamente. La secuencia de ADN genómica de ratón se aisló en un único clon BAC.

La gastroquina denominada proteína AMP-18 se expresa a elevados niveles en células del antro gástrico. La proteína es apenas detectable en el resto del estómago o duodeno, y no se encontró, o se encontró en bajos niveles, en otros tejidos corporales ensayados. El AMP-18 se sintetiza en las células de la mucosa de la superficie luminal, y se secreta junto con gránulos de mucina.

Estudios en seres humanos confirman la localización y expresión del péptido AMP-18 en mucosa gástrica humana.

Composiciones de AMP-18 aislada de tejido del antro de ratón y cerdo estimulan el crecimiento de células epiteliales de estómago, intestinales, y renales confluyentes en cultivo; también se ha demostrado que células humanas, de mono, perro y rata responden. Este efecto mitogénico (estimulación del crecimiento) se inhibe por antisueros específicos (anticuerpos) contra AMP-18, que apoya la conclusión de que AMP-18, o sus productos, por ejemplo péptidos derivados de la proteína por aislamiento de segmentos de la proteína o por síntesis, es un factor de crecimiento. De hecho, ciertos péptidos sintéticos cuyas secuencias de aminoácidos representan una región central de la proteína AMP-18 también tienen una actividad de factor de crecimiento. Los péptidos también aceleran la reparación de heridas en ensayos de cultivo tisular, lo que indica un efecto estimulador sobre la migración celular, el proceso que media la restitución de lesiones de la mucosa estomacal. Por tanto, la proteína y sus péptidos activos son motógenos. Inesperadamente, péptidos derivados de sub-dominios de la molécula precursora pueden inhibir el efecto mitogénico de péptidos sintéticos bioactivos y de la proteína natural intacta presente en extractos estomacales.

Hay 3 actividades de las proteínas y péptidos gastroquina de la presente invención. Las proteínas son motógenos porque estimulan la migración de las células. Son mitógenos porque estimulan la división celular. Funcionan como agentes citoprotectores porque mantienen la integridad del epitelio (como se muestra por la protección conferida sobre capas celulares epiteliales eléctricamente resistentes en cultivo tisular tratado con agentes dañinos tales como oxidantes o fármacos anti-inflamatorios no esteroideos AINE).

La síntesis de AMP-18 está confinada a las células epiteliales del revestimiento mucoso luminal del antro gástrico de seres humanos y otros mamíferos. En el interior de las células la proteína se co-localiza con mucinas en gránulos de secreción, y parece secretarse en el moco que cubre la membrana plasmática apical. La AMP-18 humana recombinante en E. coli ejerce su efecto mitogénico a una concentración un orden de magnitud inferior que los péptidos promotores del crecimiento derivados del centro de la proteína madura. El péptido 77-97, el péptido mitogénico más potente, es específico de secuencia de aminoácidos. Parece que los péptidos AMP son específicos de tipo celular ya que no estimulan el crecimiento de fibroblastos o células HeLa. Parece que la mitogénesis por péptidos AMP específicos está mediada por un receptor de superficie celular porque ciertos péptidos que no son mitógenos activos pueden inhibir de forma competitiva, de una manera dependiente de la concentración, los efectos estimuladores del crecimiento del péptido 58-99 y extractos celulares del antro. La AMP-18 y sus péptidos derivados muestras diversos efectos sobre las células epiteliales estomacales e intestinales lo que sugiere que podrían desempeñar una tarea crítica en la reparación después de una lesión de la mucosa gástrica. Estos incluyen citoprotección, mitogénesis, restitución, y maduración de la función de barrera después de una lesión mediada por un oxidante y/o indometacina. Lo posibles mecanismos por los que AMP-18 o sus derivados peptídicos median sus efectos pleiotrópicos incluyen estimulación de la actividad tirosina...

1. Una composición farmacéutica usada para el tratamiento de un trastorno gastrointestinal, comprendiendo dicha composición un péptido estimulador del crecimiento; estando seleccionado dicho péptido estimulador del crecimiento entre el grupo constituido por las secuencias de aminoácidos KKLQGKGPGGPPPK, LDALVKEKKLQGKGPGGPP PK, y LDALVKEKKLQGKGPGGPPPKGLMY.

2. Uso de una composición que comprende una proteína gastroquina que comprende una secuencia de aminoácidos consenso seleccionada entre el grupo constituido por VKE(K/Q)KXXGKGPGG(P/A)PPK, VKE(K/Q)KLQGKGPGG(P/A)PPK y VKE(KJQ)KGKGPGG(P/A)PPK, o un péptido seleccionado entre el grupo constituido por las secuencias de aminoácidos KKLQGKGPGGPPPK, LDALVKEKKLQGKGPGGPPPK, y LDALVKEKKLQGKGPGGPPPKGL MY para la preparación de un medicamento para el tratamiento de una lesión del tracto gastrointestinal de mamíferos, en la que tiene que estimularse la migración de células epiteliales.

3. Uso de una composición que comprende una proteína gastroquina que comprende una secuencia de aminoácidos consenso seleccionada entre el grupo constituido por VKE(K/Q)KXXGKGPGG(P/A)PPK, VKE(K/Q)KLQGKGPGG(P/A)PPK y VKE(K/Q)KGKGPGG(P/A)PPK o un péptido constituido por la secuencia de aminoácidos LDALV KEKKLQGKGPGGPPPK, para la preparación de un medicamento para la citoprotección de células epiteliales dañadas en el tracto gastrointestinal de mamíferos en la que las células epiteliales dañadas tienen que ser células a poner en contacto con dicha composición.

4. El uso de la reivindicación 3, en el que las células dañadas son una úlcera.