Productos de fusión anticuerpo-LIGHT como productos terapéuticos de cáncer.

Una composición que comprende un anticuerpo específico de tumor unido a un fragmento de una proteína LIGHT humana,

en la que el fragmento LIGHT es resistente a digestión por proteasas, en la que adicionalmente el fragmento de LIGHT es de al menos 100 aminoácidos de longitud y es suficiente para estimular linfocitos T citotóxicos contra células tumorales

Productos de fusión anticuerpo-LIGHT como productos terapéuticos de cáncer

Antecedentes Se divulgan composiciones para su uso en un procedimiento de marcado como objetivo de células tumorales con la proteína LIGHT unida a un antígeno tumoral. El marcado como objetivo reduce el crecimiento tumoral y reduce metástasis.

La escasez de células T activadas infiltrándose en tumores establecidos en huéspedes inmunocompetentes ayuda a explicar la incapacidad de los huéspedes para eliminar los tumores. Los experimentos en modelos animales así como los estudios clínicos indican que el sistema inmune puede reconocer y matar células tumorales individuales, pero un huésped no puede erradicar generalmente tumores sólidos establecidos. Hay varias explicaciones para el fallo del huésped en responder de forma efectiva a los tumores establecidos: 1) carencia de inducción de células T tempranas debida a presentación directa o indirecta pobre en los tejidos linfoides debida a un número inadecuado de células tumorales (especialmente aquellas de origen no hematopoyético) que migran al tejido linfoide; 2) número inadecuado de células inmunes que migran a los sitios tumorales debido a barreras biológicas alrededor de tejidos tumorales; 3) células T específicas de antígeno activadas agotadas o de vida corta que no consiguen combatir el crecimiento tumoral debido a repertorios limitados; 4) no responsividad o ignorancia de células T a tumores; 5) un microambiente inhibidor

o una carencia de estimulación dentro de tumores para activar el sistema inmune.

Clínicamente, un incremento en la infiltración de células T al sitio tumoral está asociada estrechamente con mejor pronóstico. Los estudios anteriores han mostrado que vacunaciones preventivas fueron efectivas en inducir el rechazo de células tumorales inoculadas. Después de que el crecimiento tumoral se ha establecido, sin embargo, las vacunaciones terapéuticas usualmente no consiguen rechazar tumores. La reducción quirúrgica de tumores no refuerza la respuesta inmune a tumores. Además, se ha comunicado que incluso la expresión de un antígeno fuerte en células tumorales fue insuficiente en promover el rechazo de un tumor establecido, a pesar de la presencia de números excesivos de células T específicas de antígenos en los tejidos linfoides. La carencia de inducción de células T y/o de células T infiltrándose en un tumor establecido es uno de los mayores obstáculos bien para técnicas naturales o bien para enfoques terapéuticos contra cánceres antigénicos. Además, la expresión insuficiente de moléculas coestimuladoras dentro de tejidos tumorales pueden fallar en activar células T que se infiltren y dar como resultado la anergia de las células T reactivas frente a tumores.

La carencia de inducción de células T tempranas se atribuye posiblemente a solamente unas pocas células tumorales que migran desde el tejido sólido hasta los tejidos linfoides para presentación directa. El análisis genético usando quimeras de médula ósea ha revelado dos modos de presentación antigénica para células T CD8+ restringidas a MHC-I. La inducción directa está mediada por el compromiso de las células T con las células que sintetizan la proteína con epítopos antigénicos, mientras que la inducción cruzada está mediada por las células que presentan antígeno de huésped que toman antígenos sintetizados por otras células. Los mecanismos para inducir células T específicas de tumores se han debatido fuertemente y hasta la fecha permanecen inconcluyentes. Comprender como y donde se presentan los tumores antigénicos a células T ayudaría a encontrar una acción terapéutica contra tumores.

LIGHT (homólogo a linfotoxina, muestra expresión inducible y compite con glicoproteína D HSV por mediador de entrada deherpesvirus, un receptor expresado por linfocitos T) es una glucoproteína transmembrana de tipo II recién identificada de la superfamilia de ligandos TNF. LIGHT (TNFSF14) es un miembro de la familia de los factores de necrosis tumoral (TNF) que interacciona con receptor de Linfotoxina β (LTβR) y mediador de la entrada de herpesvirus (HVEM) expresado principalmente en células estromales y células T, respectivamente. Se requiere la señalización LTβR para la formación de estructuras linfoides organizadas, que se pueden atribuir, al menos en parte, a su capacidad para inducir la expresión de quimiocinas y de moléculas de adhesión que atraen células T no inmunizadas y células dendríticas (DC) en órganos linfoides. La estimulación de LTβR en células estromales por LIGHT in vivo conduce a la expresión de CCL21, que atrae células T no inmunizadas en al área de células T del hígado en ausencia de LTαβ, otro ligando para LTβR. Estos resultados demuestran que LIGHT es capaz de interaccionar con LTβR para regular la expresión de quimiocina CCL21. Además, LIGHT presenta una actividad co-estimuladora independiente de CD28, potente para inducción de células T y para liderar la expansión de células T a inmunidad de células T contra tumores mejorada y/o a autoinmunidad incrementada. Se requiere señalización por medio de LTβR para la formación de tejidos linfoides organizados. La linfotoxina en receptor β (LTβR) juega un papel importante en la formación de estructuras linfoides. LTβR se activa por dos miembros de la familia TNF, linfotoxina de membrana αβ y LIGHT. LTβR juega papeles cruciales en la formación de nódulos linfáticos (LN) y en la organización distinta de zonas T, B en órganos linfoides secundarios. La vía de señalización LTpR regula la expresión de quimiocinas y moléculas de adhesión dentro de órganos linfoides secundarios. Las quimiocinas y las moléculas de adhesión controlan la migración y el posicionamiento de CD y linfocitos en el bazo. La sobre-expresión de LT o TNF solubles en tejidos no linfoides fue suficiente para promover neogénesis linfoide funcional.

LIGHT se ha llamado también HVEM-L y LT-γ. Según la nueva nomenclatura de TNF, ello se llama TNFSF14. LIGHT es una proteína de 240 aminoácidos (aa) que contiene un dominio citoplásmico de 37 aa, un dominio transmembrana de 22 aa y un dominio extracelular de 181 aa. De forma similar a otros miembros de la familia de ligandos de TNF, se predice que LIGHT se ensambla como un homotrímero. LIGHT se produce por células T activadas y se identificó primero por su capacidad para competir con glucoproteína D de HSV para unión de HVEM. LIGHT ha estado mostrando también unir el receptor de linfotoxina beta (LTβR) y el receptor señuelo (DcR3/TR6) .

LIGHT juega un papel único en la activación de células T y en la formación del tejido linfoide. Las interacciones entre LIGHT y LTβR restauran las estructuras linfoides en el hígado de ratones LTα-/-. Además, la regulación al alza de LIGHT causa activación de células T y migración en tejidos no linfoides manteniendo la formación de estructuras similares a linfoides. Por el contrario, los ratones LIGHT-/- mostraron activación de células T alterada y rechazo cardíaco retrasado. Por lo tanto, LIGHT es una molécula coestimuladora potente que también promueve la formación de tejidos linfoides para potenciar las respuestas inmunes locales. La carencia de inducción eficiente de células T en drenar tejidos linfoides y la incapacidad para expandir las células T específicas de tumores en el interior de los tumores evita la erradicación del cáncer.

Pueden llegar a establecerse micrometástasis (pequeños agregados de células cancerosas visibles microscópicamente) en una fase muy temprana en el desarrollo de tumores primarios heterogéneos y sembrar sitios de tejidos distales antes de su detección clínica. Por ejemplo, la metástasis detectable en cáncer de mama se puede observar cuando el tamaño del tumor primario es muy pequeño. Por lo tanto, en el momento del diagnóstico, muchos pacientes de cáncer tienen ya metástasis microscópicas, una observación que ha conducido al desarrollo de terapia coadyuvante postquirúrgica para pacientes con tumores sólidos. A pesar de estos avances, el éxito ha sido limitado y el tratamiento óptimo de enfermedades metastásicas continúa planteando un reto significativo en terapia del cáncer.

Una diversidad de cánceres humanos y murinos han estado demostrando ser antigénicos y capaces de reconocerse por células T. Las células T reactivas frente a tumores podrían teóricamente buscar y destruir células cancerosas positivas en antígenos tumorales y evitar los tejidos sanos circundantes. Sin embargo, las respuestas de células T que existen en la naturaleza contra malignidades en seres humanos a menudo no son suficientes para causar regresión de los... [Seguir leyendo]

1. Una composición que comprende un anticuerpo específico de tumor unido a un fragmento de una proteína LIGHT humana, en la que el fragmento LIGHT es resistente a digestión por proteasas, en la que adicionalmente el fragmento de LIGHT es de al menos 100 aminoácidos de longitud y es suficiente para estimular linfocitos T citotóxicos contra células tumorales.

2. La composición de la reivindicación 1, en la que el anticuerpo y el fragmento de la proteína LIGHT comprenden una proteína de fusión

o en la que el fragmento de la proteína LIGHT está conjugado químicamente al anticuerpo.

3. La composición de la reivindicación 1, en la que el anticuerpo está seleccionado del grupo que consiste en un anticuerpo monoclonal humanizado, un fragmento de anticuerpo que incluye la región de unión a antígenos del anticuerpo intacto, an anticuerpo quimérico, un heterominicuerpo y un anticuerpo de cadena simple.

4. La composición de la reivindicación 1, en la que el fragmento de la proteína de LIGHT comprende una sección de un dominio extracelular de la proteína LIGHT.

5. La composición de la reivindicación 1, en la que el fragmento comprende una secuencia de aminoácidos a partir de las posiciones alrededor d.

8. 240 de la proteína LIGHT humana.

6. La composición de la reivindicación 1, en la que el fragmento de LIGHT comprende una mutación en la secuencia EQLI de reconocimiento de proteasas inactivando de este modo la secuencia de reconocimiento de proteasas o en la que el sitio de proteasas está delecionado.

7. La composición de la reivindicación 5, en la que la proteína LIGHT humana tiene SEC ID N.º: 1.

8. La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 para su uso en reducir el crecimiento de tumor primario o de metástasis cancerosas.

9. La composición para su uso de la reivindicación 8, en la que el anticuerpo reconoce un antígeno tumoral de superficie.

10. La composición para su uso de la reivindicación 8, en la que el anticuerpo es específico para un antígeno tumoral seleccionado del grupo que consiste en HER2, HER4, HER8, EGFR y STEAP.

11. La composición para su uso de la reivindicación 8 que comprende adicionalmente un agente quimioterapéutico o radioterapia.

12. Una proteína quimérica que comprende una región peptídica que reconoce un antígeno tumoral y un fragmento de una proteína LIGHT, en la que el fragmento de LIGHT es resistente a digestión por proteasas, en la que adicionalmente el fragmento de LIGHT es de al menos 100 aminoácidos de longitud y es suficiente para estimular linfocitos T citotóxicos contra células tumorales.

Anti-antígenos tumorales y

LIGHT

FIG. 1 FIG. 2 FIG. 3

Crecimiento tumoral después de tratamiento con Ad-LIGHT y/o con anti-Her 2

Días después de inoculación tumoral

FIG. 4

Crecimiento tumoral después de tratamiento con anti-Her 2

Días después de inoculación tumoral

FIG. 5 FIG. 6