El uso de las coordenadas atómicas de H32, W33 y L94 como se define en la Figura 9 para identificar un inhibidor potencial de una molécula que comprende un bolsillo de unión de tipo TAD de E2 del VPH que comprende los pasos de:

a) el uso de las coordenadas atómicas de H32, W33 y L94 como se define en la Figura 9 para generar una estructura tridimensional de la molécula que comprende un bolsillo de unión de tipo TAD de E2;

b) emplear dicha estructura 3-D para diseñar o seleccionar dicho inhibidor potencial;

c) sintetizar dicho inhibidor;

d) poner en contacto dicho inhibidor con dicha molécula para determinar la capacidad de dicho inhibidor potencial para interaccionar con dicha molécula

Cocristalización del dominio de transactivación E2 del virus del papiloma humano/inhibidor y coordenadas de rayos X que definen el bolsillo de unión del inhibidor.

Campo de la invención

La invención esta relacionada con la proteína E2 del virus del papiloma humano, concretamente la estructura cristalina del dominio de transactivación de la proteína E2 del virus del papiloma humano 11 (VPH-11) que forma un complejo con un inhibidor. En particular, la invención proporciona coordenadas de la estructura cristalina que definen un bolsillo de unión del inhibidor y describe un modelo estructural tridimensional mediante el que se pueden identificar inhibidores potenciales que encajarían en este bolsillo. También se describen métodos para facilitar el diseño y la selección de inhibidores de la actividad de la proteína E2 implicada en la replicación de DNA de papilomavirus, en concreto del papilomavirus humano.

Antecedentes de la invención

Los papilomavirus (PV) son virus de DNA sin envoltura que inducen lesiones hiperproliferativas del epitelio. Estos virus están muy extendidos en la naturaleza y se han reconocido en vertebrados superiores. Se han caracterizado virus en humanos, ganado vacuno, conejos, caballos y perros, entre otros. El primer papilomavirus descrito fue el papilomavirus del conejo común (CRPV), descrito en 1933. Desde entonces, el papilomavirus del conejo común (CRPV) y el papilomavirus bovino tipo 1 (BPV-1) han sido utilizados como prototipos experimentales para estudios sobre los papilomavirus. La mayor parte de los papilomavirus animales están asociados a lesiones proliferativas exclusivamente epiteliales y la mayoría de las lesiones en animales son cutáneas. En los humanos existen más de 75 tipos de papilomavirus (VPH) identificados que se han catalogado en función de la localización de la infección: epitelio cutáneo, epitelio de las mucosas (oral y genital). Las enfermedades relacionadas con la piel incluyen verrugas planas, verrugas plantares, etc. Las enfermedades relacionadas con las mucosas incluyen papilomas laríngeos y enfermedades anogenitales como los carcinomas cervicales (Fields. Virology. 3rd ed. Philadelphia, NY: Lippincott - Raven Pub.; 1996).

Existen más de 25 tipos del VPH implicados en las enfermedades anogenitales; estos se agrupan en tipos de "alto riesgo" o de "bajo riesgo". Los tipos de bajo riesgo incluyen el VPH tipo 6 y el tipo 11, que inducen lesiones mayormente benignas como las condyloma acuminata (verrugas genitales) y lesiones intraepiteliales escamosas de bajo grado (SIL). En Estados Unidos hay unos 5 millones de personas afectadas de verrugas genitales de las que el 90% se atribuye a VPH-6 y VPH-11.

Los tipos de alto riesgo están asociados a SIL de alto grado y cáncer cervical, y mayormente incluyen los tipos 16, 18, 31, 33, 35, 45 y 52 del VPH. La progresión desde una SIL de bajo grado a una de alto grado es mucho más frecuente en el caso de lesiones que contienen VPH-16 y 18 de elevado riesgo en comparación con aquellas que contienen tipos del VPH de bajo riesgo. Además, en el cáncer cervical solamente cuatro tipos del VPH se detectan con frecuencia (los tipos 16, 18, 31 y 45). A escala mundial se diagnostican anualmente cerca de 500.000 casos nuevos de cáncer de cérvix invasivo (Fields, 1996, supra).

El tratamiento para las verrugas genitales incluye la eliminación física como es la crioterapia, el láser de CO₂, la electrocirugia o la extirpación quirúrgica. También cabe la posibilidad de utilizar agentes citotóxicos como el ácido tricloroacético (ATC), la podofilina o el podofilox. También se dispone de agentes inmunomoduladores como Interferón o Imiquimod (Aldara®, 3M Pharmaceuticals). Estos tratamientos no son completamente efectivos en la eliminación de la totalidad de las partículas víricas y conllevan tanto un elevado coste como unos efectos secundarios desagradables. Además las verrugas recurrentes son comunes (Beutner & Ferenczy. Amer J Med. 1997; 102(5A): 28-37).

La ineficacia de los métodos actuales de tratamiento de las infecciones por VPH ha puesto de manifiesto la necesidad de identificar nuevos sistemas de control o eliminación de estas infecciones. En los últimos años se ha dedicado mucho esfuerzo a encontrar compuestos antivirales y, en especial, compuestos con capacidad para interferir en la replicación vírica (Hughes y Romanos. Nucleic Acids Res. 1993; 21: 5817-5823; Clark, et al. Antiviral Res. 1998; 37(2): 97-106; Hajduk, et al. J Med Chem. 1997; 49(20): 3144-3150 y Cowsert, et al. Antimicrob Agents Chemother. 1993; 37(2): 171-177). Por esta razón, ha adquirido importancia el estudio de la genética de los VPH con el fin de identificar posibles dianas quimioterapéuticas que contengan y posiblemente eliminen cualquier enfermedad causada por una infección de VPH.

El ciclo de vida de PV se encuentra estrechamente relacionado con la diferenciación de los queratinocitos. Se piensa que la infección tiene lugar en un lugar de interrupción histica del epitelio basal. A diferencia de lo que sucede con células normales, la división celular continúa a medida que la célula experimenta una diferenciación vertical. Mientras las células infectadas sufren una diferenciación progresiva, la maquinaria de replicación celular se mantiene lo que permite el aumento de la replicación de DNA vírico, situación que finalmente dará lugar a una expresión génica tardía y a un ensamblaje de viriones en queratinocitos con diferenciación terminal, y a la liberación de partículas víricas (Fields, supra).

La cadena codificante de cada uno de los genomas del papilomavirus contiene aproximadamente diez marcos abiertos de lectura (ORF) designados para traducción que se han clasificado en ORF tempranos u ORF tardíos. Los genes de E1 a E8 se expresan al principio del ciclo de replicación vírica. Los dos genes tardíos (L1 y L2) codifican las proteínas de cápside mayor y menor, respectivamente. Los productos de los genes E1 y E2 intervienen en la replicación de DNA vírico mientras que E5, E6 y E7 modulan la proliferación de las células huésped. Las funciones de los productos de los genes E3, E4 y E8 actualmente se desconocen.

Hay estudios sobre el VPH que han demostrado que las proteínas E1 y E2 son las únicas proteínas víricas necesarias para la replicación de DNA vírico (Kuo, et al. J Biol Chem. 1994; 30: 24058-24065). Este requisito es similar al del virus del papiloma bovino tipo 1 (BPV-1). De hecho, existe un alto grado de similitud entre las proteínas E1 y E2 y las secuencias ori de todos los papilomavirus (PV), sin importar la especie o el tipo vírico (Kuo, et al. 1994, supra).

Cuando la replicación de DNA vírico tiene lugar in vitro, en la que la proteína E1 está presente en exceso, la replicación puede continuar en ausencia de E2. In vivo, en presencia de una cantidad enorme de DNA, la replicación requiere de la presencia tanto de E1 como de E2. Se piensa que el mecanismo de iniciación de la replicación in vivo implica la unión conjunta de E1 y E2 al origen, lo que conduce a la constitución de un complejo terciario de proteína y DNA (Mohr, et al. Science. 1990; 250: 1694-1699). La proteína E2 es un activador transcripcional que se une a la proteína E1 y debido a esto potencia la unión de E1 al origen de replicación de BVP (Seo, et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 1993b; 90: 2865-2869). De esta forma, E2 actúa como un factor de especificidad cuando dirige a E1 hacia el origen de replicación (Sedman y Stenlund. Embo J. 1995; 14: 6218-6228). En el caso del VPH, Lui et al. sugirieron que E2 estabiliza la unión de E1 a la secuencia ori (J Biol Chem. 1995; 270(45): 27283-27291 y McBride et al. J Biol Chem. 1991; 266: 18411-18414). Estas interacciones de DNA con proteína y proteína con proteína se dan en el origen de la replicación de DNA (Sverdrup y Myers, supra).

Las proteínas E2 de ~45 kD descritas en numerosos serotipos animales y humanos comparten una organización común en dos dominios. El dominio de transactivación (TAD) N-terminal tiene una longitud de unos 220 aminoácidos y el dominio de unión a DNA (DBD) C-terminal de 100 aminoácidos. Los dos dominios están unidos por una región enlazante flexible.

E2 activa la replicación vírica a través de la unión conjunta con la proteína iniciadora vírica E1 al origen de la replicación de DNA, dando como resultado al final, hexámeros de E1 funcionales. E2 también es un regulador central de la transcripción vírica. Interactúa con factores de transcripción...

1. El uso de las coordenadas atómicas de H32, W33 y L94 como se define en la Figura 9 para identificar un inhibidor potencial de una molécula que comprende un bolsillo de unión de tipo TAD de E2 del VPH que comprende los pasos de:

a) el uso de las coordenadas atómicas de H32, W33 y L94 como se define en la Figura 9 para generar una estructura tridimensional de la molécula que comprende un bolsillo de unión de tipo TAD de E2;

b) emplear dicha estructura 3-D para diseñar o seleccionar dicho inhibidor potencial;

c) sintetizar dicho inhibidor;

d) poner en contacto dicho inhibidor con dicha molécula para determinar la capacidad de dicho inhibidor potencial para interaccionar con dicha molécula.

2. El uso de acuerdo con la reivindicación 1 en el que se utiliza en (a) las coordenadas atómicas de H29, H32, W33, L94 y T97 como se define en la Figura 9.

3. El uso de acuerdo con la reivindicación 1 en el que se utiliza en (a) las coordenadas atómicas de L15, H29, H32, W33, 136, E39, K68, N71, A72, L94 y T97 como se define en la Figura 9.

4. Un método para evaluar el potencial de una entidad química para asociarse con una molécula o complejo que comprende una cavidad profunda definida por las coordenadas de la estructura de los aminoácidos H32, W33 y L94 del TAD de E2 del VPH 11 de acuerdo con la Figura 9 o un modelo tridimensional del mismo que comprende los pasos:

i) emplear medios computacionales para realizar una operación de ajuste entre la entidad química y una molécula o complejo que comprende un bolsillo de unión definido por las coordenadas de la estructura de los aminoácidos H32, W33 y L94 del TAD de E2 del VPH 11 como se define en la Figura 9;

ii) analizar los resultados de dicha operación de ajuste para evaluar la asociación entre la entidad química y el bolsillo de unión VPH.

5. Un método de acuerdo con la reivindicación 4 en el que se utiliza la molécula o complejo molecular que comprende un bolsillo de unión definido por las coordenadas de la estructura de los aminoácidos H29, H32, W33, L94 y T97 como se define en la Figura 9.

6. Un método de acuerdo con la reivindicación 4 en el que se utiliza la molécula o complejo molecular que comprende un bolsillo de unión definido por las coordenadas de la estructura de los aminoácidos L15, H29, H32, W33, 136, E39, K68, N71, A72, L94 y T97 como se define en la Figura 9.