CELULAS QUE EXPRESAN UN RECEPTOR DE CELULAS T MODIFICADO.

Una célula T que presenta al menos un receptor de células T (TCR) heterodimérico α

ß exógeno transducido o transfectado, en el que las cadenas α y ß de TCR comprenden cada una una secuencia transmembrana fusionada en su extremo N-terminal a una secuencia de dominio constante extracelular, fusionada a su vez en su extremo N-terminal a una secuencia de región variable, estando dicho TCR anclado a la membrana por la secuencia transmembrana, comprendiendo dicha TCR un puente disulfuro entre restos de dominio constante extracelular α y ß que no está presente en TCR nativos, siendo dicho puente disulfuro entre restos de cisteína que sustituyen a restos cuyos átomos de carbono ß están separados menos de 0,6 nm en la estructura de TCR nativa, sustituyendo dichos restos de cisteína a Thr 48 del exón 1 de TRAC*01 y Ser 57 del exón 1 de TRBC1*01 o TRBC2*01; o Thr 45 del exón 1 de TRAC*01 y Ser 77 del exón 1 de TRBC1*01 o TRBC2*01; o Tyr 10 del exón 1 de TRAC*01 y Ser 17 del exón 1 de TRBC1*01 o TRBC2*01; o Thr 45 del exón 1 de TRAC*01 y Asp 59 del exón 1 de TRBC1*01 o TRBC2*01; o Ser 15 del exón 1 de TRAC*01 y Glu 15 del exón 1 de TRBC1*01 o TRBC2*01

La presente invención se refiere a células, particularmente células T, que expresan receptores de células T (TCR) modificados, a su preparación y a su uso en terapia. Antecedentes de la Invención TCR nativos

Como se describe en, por ejemplo, el documento WO 99/60120, los TCR median el reconocimiento de complejos específicos de Complejo Mayor de Histocompatibilidad (MHC)péptido por células T y, como tales, son esenciales para el funcionamiento de la rama celular del sistema inmune.

Los anticuerpos y TCR son los dos únicos tipos de moléculas que reconocen antígenos de manera específica y, de este modo, el TCR es el único receptor para antígenos peptídicos particulares presentados en el MHC, siendo con frecuencia el péptido extraño el único signo de anomalía dentro de una célula. El reconocimiento por células T se produce cuando una célula T y una célula presentadora de antígenos (APC) están en contacto físico directo, y se inicia por ligación de TCR específicos de antígeno con complejos de pMHC.

El TCR nativo es una proteína de superficie celular heterodimérica de la superfamilia de las inmunoglobulinas que se asocia con proteínas invariantes del complejo CD3 implicado en mediar la transducción de señales. Los TCR existen en formas αβ y γδ, que son estructuralmente similares pero tienen localizaciones anatómicas, y probablemente funciones, bastante diferentes. Los ligandos de MHC de clase I y clase II también son proteínas de la superfamilia de las inmunoglobulinas, pero están especializados en la presentación de antígenos, con un sitio de unión a péptido altamente polimórfico que les permite presentar una serie diversa de fragmentos peptídicos cortos en la superficie celular de APC.

Se sabe que dos clases de proteínas adicionales son capaces de funcionar como ligandos de TCR. (1) Los antígenos CD1 son moléculas relacionadas con el MHC de clase I cuyos genes se localizan en un cromosoma diferente de los antígenos clásicos del MHC de clase I y clase II. Las moléculas CD1 son capaces de presentar restos peptídicos y no peptídicos (por ejemplo. lípidos, glucolípidos) a células T de una manera análoga a los complejos de MHC de clase I y clase II-pep convencionales. Véase, por ejemplo (Barclay y col., (1997) The Leucocyte Antigen Factsbook 2ª Edición, Academic Press) y (Bauer (1997) Eur J Immunol 27 (6) 1366-1373)) (2) Los superantígenos bacterianos son toxinas solubles que son capaces de unirse a moléculas de MHC de clase II y a un subconjunto de TCR (Fraser (1989) Nature 339 221-223). Muchos superantígenos muestran especificidad por uno o dos segmentos Vbeta, mientras que otros muestran una unión más promiscua. En cualquier caso, los superantígenos son capaces de inducir una respuesta inmune aumentada en virtud de su

capacidad para estimular subconjuntos de células T de un modo policlonal.

La porción extracelular de los TCR αβ y γδ heterodiméricos nativos consiste en dos polipéptidos, cada uno de los cuales tiene un dominio constante extracelular proximal a la membrana y una región variable distal a la membrana. Cada uno del dominio constante extracelular y la región variable incluye un enlace disulfuro intracatenario. Las regiones variables contienen los bucles altamente polimórficos análogos a las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de los anticuerpos. La CDR3 de los TCR αβ interacciona con el péptido presentado por el MHC y las CDR1 y 2 de los TCR αβ interaccionan con el péptido y el MHC. La diversidad de secuencias de TCR se genera mediante reordenación somática de genes variables (V), de diversidad (D), de unión (J) y constantes ligados, componiendo los productos génicos de los mismos la región variable.

Los polipéptidos de cadena α y γ funcionales están formados por dominios V-J-C reordenados, mientras que las cadenas β y δ consisten en dominios V-D-J-C (véase la Figura 1). Cada TCR funcional posee una de las posibles variantes de cada dominio (véanse las Figuras 7 y 8 para las secuencias de ADN de todos los dominios C y V de TCR conocidos de las cadenas de α y β de TCR, respectivamente, véase también (Le Franc y col., (2001) The T cell receptor Factsbook, Academic Press) para una lista completa de las secuencias de ADN y aminoácidos de todos los dominios de TCR conocidos). Se introduce un nivel de diversidad adicional en los TCR αβ mediante la recombinación in vivo de dominios de TCR acortados. El dominio constante extracelular tiene un motivo proximal a la membrana y un motivo de inmunoglobulina. Existen dominios constantes de cadena α y δ sencilla, conocidos como TRAC y TRDC, respectivamente. El dominio constante de la cadena β está compuesto por uno de dos dominios constantes β diferentes, conocidos como TRBC1 y TRBC2 (nomenclatura IMGT). Existen cuatro cambios de aminoácidos entre estos dominios constantes β, estando tres de los mismos en el exón 1 de TRBC1 y TRBC2: N4K5→K4N5 y F37→Y, siendo el último cambio de aminoácido entre las dos regiones constantes de cadena β de TCR en el exón 3 de TRBC1 y TRBC2: V1→E. (numeración IMGT, diferencias TRBC1→TRBC2). El domino γ constante está compuesto por uno de TRGC1, TRGC2(2x) o TRGC2(3x). Los dos dominios constantes TRGC2 difieren solamente en el número de copias de los aminoácidos codificados por el exón 2 de este gen que están presentes. Los dominios constantes de TCR incluyen una secuencia transmembrana, cuyos aminoácidos anclan las cadenas de TCR a la membrana de la superficie celular. Existen 46 dominios TRAV diferentes y 56 dominios TRBV. 52 genes funcionales diferentes codifican los dominios TRAJ, mientras que 12-13 genes funcionales codifican los dominios TRBJ. 2 genes funcionales diferentes codifican los dominios TRBD.

El grado de cada uno de los dominios constantes extracelulares de TCR, unidos por las secuencias transmembrana, es un tanto variable. Sin embargo, un experto en la materia puede determinar fácilmente la posición de los límites de los dominios usando una referencia tal como The T Cell Receptor Facts Book, Lefranc y Lefranc, Publ. Academic Press 2001.

Inmunoterapia

La inmunoterapia implica mejorar la respuesta inmune de un paciente contra células cancerosas o infectadas. La inmunoterapia activa se lleva a cabo mediante estimulación del sistema inmune endógeno de pacientes portadores de tumores. La inmunoterapia pasiva, o adoptiva, implica la transferencia de células inmunocompetentes al paciente. (Paul (2002) Curr Gene Therapy 2 91-100). Existen tres amplios enfoques para la inmunoterapia adoptiva que se han aplicado en la clínica para el tratamiento de enfermedades metastásicas; células asesinas activadas por linfocinas (LAK), terapia con autolinfocitos (ALT) y linfocitos infiltrantes de tumores (TIL). (Paul (2002) Curr Gene Therapy 2 91-100).

Una variación propuesta recientemente de terapia adoptiva con células T es el uso de técnicas de terapia génica para introducir TCR específicos para complejos de péptido-MHC específicos de cáncer conocidos en las células T de pacientes con cáncer. Por ejemplo, el documento (WO 01/55366) desvela procedimientos basados en retrovirus para transfectar, preferentemente, células T con TCR heterólogos. Este documento indica que estas células transfectadas podrían usarse para la presentación en la superficie celular de variantes de TCR como un medio para identificar TCR de alta afinidad o para inmunoterapia. Se describen procedimientos para la clonación molecular de ADNc de un TCR murino restringido por HLA específico de p53 humano y la transferencia de este ADNc a células T humanas en la Solicitud de Patente de Estados Unidos publicada Nº 20020064521. Este documento indica que la expresión de este TCR murino da como resultado el reconocimiento de p53 humano procesado endógenamente expresado en células tumorales estimuladas con el péptido derivado de p53 149-157 presentado por HLA A*0201 y reivindica el uso del TCR murino en inmunoterapia adoptiva anticancerosa. Sin embargo, la concentración del péptido de estimulación necesaria para conseguir una estimulación de células T semimáxima de las células T transfectadas era de aproximadamente 250 veces la requerida por células T que expresan solamente el TCR murino. Como señalaron los autores “La diferencia en el nivel de sensibilidad al péptido es la que podría esperarse de una línea transfectante que contuviera múltiples heterodímeros de TCR diferentes como resultado de la asociación independiente de las cuatro cadenas de TCR hu...

1. Una célula T que presenta al menos un receptor de células T (TCR) heterodimérico αβ exógeno transducido o transfectado, en el que las cadenas α y β de TCR comprenden cada una una secuencia transmembrana fusionada en su extremo N-terminal a una secuencia de dominio constante extracelular, fusionada a su vez en su extremo N-terminal a una secuencia de región variable, estando dicho TCR anclado a la membrana por la secuencia transmembrana, comprendiendo dicha TCR un puente disulfuro entre restos de dominio constante extracelular α y β que no está presente en TCR nativos, siendo dicho puente disulfuro entre restos de cisteína que sustituyen a restos cuyos átomos de carbono β están separados menos de 0,6 nm en la estructura de TCR nativa, sustituyendo dichos restos de cisteína a

Thr 48 del exón 1 de TRAC*01 y Ser 57 del exón 1 de TRBC1*01 o TRBC2*01; o Thr 45 del exón 1 de TRAC*01 y Ser 77 del exón 1 de TRBC1*01 o TRBC2*01; o Tyr 10 del exón 1 de TRAC*01 y Ser 17 del exón 1 de TRBC1*01 o TRBC2*01; o Thr 45 del exón 1 de TRAC*01 y Asp 59 del exón 1 de TRBC1*01 o TRBC2*01; o Ser 15 del exón 1 de TRAC*01 y Glu 15 del exón 1 de TRBC1*01 o TRBC2*01.

2. Una célula T de acuerdo con la reivindicación 1, en la que al menos dichas secuencias de las cadenas α y β de TCR distintas de las regiones determinantes de complementariedad de la región variable corresponden a secuencias α y β de TCR humano.

3. Una célula T de acuerdo con la reivindicación 1 o reivindicación 2 que presenta una pluralidad de dichos TCR.

4. Una célula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que en dicho TCR los restos de cisteína que forman el enlace disulfuro intercatenario presente en TCR nativos se reemplazan por restos que no son de cisteína.

5. Una célula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en la que en dicho TCR no está presente un resto de cisteína no emparejado presente en las cadenas β de TCR nativo.

6. Un procedimiento para obtener una célula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes, comprendiendo dicho procedimiento incubar una célula huésped

que alberga un vector de expresión que codifica un TCR, como se define en cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en condiciones que causen la expresión del TCR.

7. Un procedimiento de preparación de una pluralidad de células de acuerdo con 5 cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, comprendiendo dicho procedimiento:

(a) la transfección in vitro de una población de células aisladas de un paciente con un vector de expresión que codifica un TCR específico para una célula diana, siendo dicho TCR como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5,

(b) el cultivo in vitro opcional de las células transfectadas.

8. Una composición farmacéutica infundible o inyectable que comprende una pluralidad de células T de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 junto con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

9. El uso de una pluralidad de células T de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la preparación de una composición para el tratamiento de cáncer, EICH, infección, rechazo de órganos o enfermedad autoinmune.