Receptores de linfocitos T recombinados de una sola cadena.

Un receptor de linfocitos T de una sola cadena (scTCR) que contiene un segmento α

constituido por una secuencia de la región variable de la cadena α del TCR fusionada al extremo N terminal de una secuencia extracelular de la región constante de la cadena α del TCR, un segmento β constituido por una región variable de la cadena α del TCR fusionada al extremo N terminal de una secuencia extracelular de la región constante de la cadena β del TCR, y una secuencia conectora que une el extremo C terminal del segmento α con el extremo N terminal del segmento β, o vice versa, donde las secuencias extracelulares de las regiones constantes de los segmentos α y β están unidas por un enlace disulfuro entre los residuos de cisteína sustituidos en Thr 48 del exón 1 de TRAC*01 y Ser 57 del exón 1 de TRBC1*01 o TRBC2*01; o

Thr 45 del exón 1 de TRAC*01 y Ser 77 del exón 1 de TRBC1*01 o TRBC2*01; o

Tyr 10 del exón 1 de TRAC*01 y Ser 17 del exón 1 de TRBC1*01 o TRBC2*01; o

Thr 45 del exón 1 de TRAC*01 y Asp 59 del exón 1 de TRBC1*01 o TRBC2*01; o

Ser 15 del exón 1 de TRAC*01 y Glu 15 del exón 1 de TRBC1*01 o TRBC2*01;

siendo la longitud de la secuencia conectora y la posición del enlace disulfuro tales que las secuencias de las regiones variables de los segmentos α y β están mutuamente orientadas esencialmente como en los receptores de linfocitos T α β nativos

Receptores de linfocitos T recombinados de una sola cadena

La presente invención se refiere a receptores de linfocitos T (TCR) de una sola cadena. Antecedentes de la invención

TCR nativos

Como se describe por ejemplo en WO 99/612, los TCR son mediadores en el reconocimiento por los linfocitos T de complejos péptido-Complejo Mayor de Histocompatibilidad (MHC) específicos y, como tales, son esenciales para el funcionamiento de la rama celular del sistema ¡nmunitario.

Los anticuerpos y los TCR son los únicos dos tipos de moléculas que reconocen antfgenos de manera específica, y por lo tanto el TCR es el único receptor para antígenos peptídicos particulares presentados por el MHC, siendo a menudo el péptido foráneo el único signo de una anomalía dentro de una célula. El reconocimiento de un linfocito T se produce cuando un linfocito T y una célula presentadora de antígeno (APC) están en contacto físico directo y se inicia mediante la unión de los TCR específicos para el antígeno a los complejos pMHC.

El TCR nativo es una proteína heterodimérica de la superficie celular de la superfamilia de las inmunoglobulinas que se asocia a proteínas invariables del complejo CD3 involucradas en la mediación de la transducción de la señal. Los TCR existen en las formas a(3 y yó, que son estructuralmente similares pero tienen localizaciones anatómicas y probablemente funciones bastante distintas. Los ligandos MHC de clase I y clase II también son proteínas de la superfamilia de las inmunoglobulinas pero están especializados en la presentación de antígenos, con un sitio de unión del péptido altamente polimórfico que les permite presentar una matriz variada de fragmentos de péptldos cortos en la superficie de las células APC.

Se conocen otras dos clases de proteínas capaces de funcionar como ligandos de TCR. (1) los antígenos CD1 son moléculas relacionadas a MHC clase I cuyos genes se encuentran en un cromosoma diferente del de los antígenos clásicos MHC de clase I y clase II. Las moléculas CD1 son capaces de presentar residuos peptídicos y no peptídicos (por ejemplo lípidos, glucolípidos) a los linfocitos T de manera análoga a los complejos péptido-MHC de las clases convencionales I y II. Véase, por ejemplo (Barclay et al, (1997)The Leucocyte Antigen Factsbook 2a Edición, Academic Press) y (Bauer (1997) Eur J Immunol 27 (6) 1366-1373)) (2) Los superantígenos bacterianos son toxinas solubles capaces de unirse tanto a moléculas MHC clase II como a un subconjunto de TCR (Fraser (1989) Nature 339 221-223). Muchos superantígenos tienen especificidad por uno o dos segmentos Vbeta, mientras que otros presentan una unión más promiscua. En cualquier caso, los superantígenos son capaces de suscitar una mayor respuesta inmunitaria en virtud de su capacidad de estimular los subconjuntos de linfocitos T de manera pollclonal.

La porción extracelular de los apTCR heterodiméricos nativos consiste en dos polipéptidos, cada uno de los cuales tiene un dominio constante proximal a la membrana y un dominio variable distal a la membrana (véase Figura 1). Cada uno de los dominios constantes y variables contiene un enlace disulfuro ¡ntracatenarlo. Los dominios variables contienen los bucles altamente polimórficos análogos a las regiones determinantes de la complementariedad (CDR) de los anticuerpos. CDR3 de los TCR interacciona con el péptido presentado por el MHC, y los CDR 1 y 2 interaccionan con el péptido y el MHC. La diversidad de secuencias de los TCR se genera a través del reordenamiento somático de los genes ligados variable (V), diversidad (D), unión (J) y constante. Los polipéptidos de cadena a funcionales están formados por regiones V-J-C, reordenadas, mientras que las cadenas p constan de regiones V-D-J-C. El dominio constante extracelular tiene una región proximal a la membrana y una región de inmunoglobulina. Existe un único dominio constante de cadena a, conocido como TRAC, y dos dominios constantes p diferentes, conocidos como TRBC1 y TRBC2 (nomenclatura IMGT). Existen cuatro cambios de aminoácidos entre estos dominios constantes p, tres de los cuales están dentro de los dominios utilizados para producir los TCR de una sola cadena de la presente Invención. Estos cambios están todos dentro del exón 1 de TRBC1 y TRBC2: N4K5- >K4N5 y F37->Y (numeración IMGT, diferencias TRBC1->TRBC2), con el cambio de aminoácido final entre las dos regiones constantes de la cadena p de TCR en el exón 3 de TRBC1 y TRBC2: Vi->E. La extensión de cada uno de los dominios extracelulares de TCR es algo variable. Sin embargo, un experto en la materia puede determinar fácilmente la posición de los límites del dominio utilizando una referencia como The T Cell Receptor Facts Book, Lefranc & Lefranc, Publ. Academic Press 21.

TCR de una sola cadena

Los TCR de una sola cadena (scTCR) son constructos artificiales que constan de una sola hebra de aminoácidos, que al igual que los TCR heterodiméricos nativos se unen a complejos péptido-MHC. Desafortunadamente, los intentos de producir scTCR análogos a los alfa/beta funcionales mediante simple unión de las cadenas alfa y beta de modo que ambas se expresen en un marco de lectura abierto no han tenido éxito, presumiblemente debido a la

inestabilidad natural del apareamiento del dominio soluble alfa-beta.

En consecuencia, han sido necesarias técnicas especiales que usan diferentes truncamientos de una o ambas de las cadenas alfa y beta para la producción de los scTCR. Estos formatos parecen ser aplicables solamente a una gama muy limitada de las secuencias de los scTCR. Soo Hoo et al (1992) PNAS. 89 (1): 4759-63 Informan acerca de la expresión de un TCR de ratón en un formato de una sola cadena a partir del clon 2C del linfocito T utilizando una cadena beta y alfa truncadas unidas con un conector de 25 aminoácidos y expresión en perlplasma bacteriano (véase también Schodin et al (1996) Mol. Immunol. 33 (9): 819-29). Este diseño también forma la base del TCR de una sola cadena m6 informado por Holler et al (2) PNAS. 97 (1): 97 (1): 5387-92 que se deriva del scTCR 2C y se une al mismo aloepítopo restringido al H2-Ld. Shusta et al (2) Nature Biotechnology 18: 754-759 Informan el uso de constructos de TCR 2C de una sola cadena en experimentos de presentación en levaduras, que produjeron TCR mutados con mayores estabilidad térmica y solubilidad, este informe también demostró la capacidad de estos TCR 2C expresados de unirse selectivamente a células que expresan su pMHC cognado. Khandekar et al (1997) J. Biol Chem 272 (51): 3219-7 informan de un diseño similar para el TCR D1 múrido, aunque este scTCR se fusionó a MBP y se expresó en el citoplasma bacteriano (véase también Haré et al (1999) Nat, Struct. Biol 6 (6): 574-81). Hilyard et al (1994) PNAS. 91 (19): 957-61 informan de un scTCR humano específico para la protema de matriz del virus de la gripe en HLA-A2, usando un diseño Va-conector-Vp y expresado en periplasma bacteriano.

Chung et al (1994) PNAS. 91 (26) 12654-8 Informan de la producción de un scTCR humano utilizando un diseño Va- conector-Vp-Cp y expresión en la superficie de una línea celular de mamífero. Este Informe no Incluye ninguna referencia a la unión específica HLA-péptido del scTCR. Plaksin et al (1997) J. Immunol. 158 (5): 2218-27 Informan de un diseño Va-conector-Vp-Cp similar para producir un scTCR múrido específico para un epítopo gp 12-H-2Dd de VIH. Este scTCR se expresa como cuerpos de inclusión bacterianos y se repliega in vitro. WO 99/18129 da a conocer un constructo de scTCR fusionado a una región constante de cadena ligera de un anticuerpo o un fragmento de éste.

Uso terapéutico

Existe la necesidad de grupos para administración dirigida capaces de localizarse en células afectadas por procesos patológicos. Dichos grupos para administración dirigida se podrían utilizar para bloquear directamente la acción 'dirigida erróneamente1 del sistema inmunitario responsable de la enfermedad autolnmunltaria o como una forma de administrar citotóxicos a células cancerosas.

Idealmente, las moléculas adecuadas para estas aplicaciones requieren una afinidad especial por un marcador celular involucrado directamente en el proceso patológico pertinente. Los anticuerpos han sido utilizados para este fin.

Uso en cribado

Varias interacciones celulares y respuestas celulares importantes, incluida la sinapsis ¡nmunológlca mediada por TCR, son controladas mediante contactos realizados entre receptores de superficie celular y llgandos presentados en las superficies de otras células. Estos tipos de contactos moleculares específicos son de vital Importancia para la regulación bioquímica correcta en el cuerpo humano y por lo tanto, se están estudiando... [Seguir leyendo]

1. Un receptor de linfocitos T de una sola cadena (scTCR) que contiene un segmento a constituido por una secuencia de la región variable de la cadena a del TCR fusionada al extremo N terminal de una secuencia extracelular de la región constante de la cadena a del TCR, un segmento (3 constituido por una región variable de la cadena (3 del TCR fusionada al extremo N terminal de una secuencia extracelular de la región constante de la cadena (3 del TCR, y una secuencia conectora que une el extremo C terminal del segmento a con el extremo N terminal del segmento (3, o vice versa, donde las secuencias extracelulares de las regiones constantes de los segmentos a y (3 están unidas por un enlace disulfuro entre los residuos de cisterna sustituidos en

Thr 48 del exón 1 de TRAC*1 y Ser 57 del exón 1 de TRBC1*1 o TRBC2*1; o

Thr 45 del exón 1 de TRAC*1 y Ser 77 del exón 1 de TRBC1*1 o TRBC2*1; o

Tyr 1 del exón 1 de TRAC*1 y Ser 17 del exón 1 de TRBC1*1 o TRBC2*1; o

Thr 45 del exón 1 de TRAC*1 y Asp 59 del exón 1 de TRBC1*1 o TRBC2*1; o

Ser 15 del exón 1 de TRAC*1 y Glu 15 del exón 1 de TRBC1*1 o TRBC2*1;

siendo la longitud de la secuencia conectora y la posición del enlace disulfuro tales que las secuencias de las regiones variables de los segmentos a y (3 están mutuamente orientadas esencialmente como en los receptores de linfocitos T a(3 nativos.

2. Un scTCR como el que se reivindica en la reivindicación 1, en el que las secuencias extracelulares de las regiones constantes presentes en los segmentos a y (3 corresponden a las regiones constantes de las cadenas a y (3 de un TCR nativo truncadas en sus extremos C terminales de modo que los residuos de cisterna que forman el enlace disulfuro intercatenario nativo del TCR son excluidos.

3. Un scTCR como el que se reivindica en la reivindicación 1, en el que las secuencias extracelulares de las regiones constantes presentes en los segmentos a y (3 corresponden a las regiones constantes de las cadenas a y (3 de un TCR nativo en el cual los residuos de cisterna que forman el enlace disulfuro intercatenario nativo están sustituidos por otro residuo de aminoácido.

4. Un scTCR como el que se reivindica en la reivindicación 3, en el que dichos residuos de cisterna están sustituidos por serina o alanina.

5. Un scTCR como el que se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que la secuencia conectora tiene la fórmula -P-AA-P- en la que P es prollna y AA representa una secuencia de aminoácidos en la que los aminoácidos son glicina y serina.

6. Un scTCR, como el que se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones precedentes en el que un residuo de cisterna no apareado presente en la cadena (3 del TCR nativo no está presente.

7. Un complejo multivalente de receptores de linfocitos T (TCR) que contiene varios scTCR como el reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones precedentes.

8. Un scTCR como el reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o un complejo como el reivindicado en la reivindicación 7 que está unido covalentemente a un agente terapéutico.

9. Una composición que contiene un scTCR o un complejo multivalente de scTCR como los reivindicados en cualquiera de las reivindicaciones precedentes y un portador farmacéuticamente aceptable.

1. Una molécula de ácido nucleico que contiene una secuencia que codifica un scTCR como el reivindicado en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

11. Un vector que contiene una molécula de ácido nucleico como la reivindicada en la reivindicación 1.