Receptores de linfocitos T.

Un receptor de linfocitos T (TCR) que tiene la propiedad de unirse al complejo YLEPGPVTA (SEQ ID No:

1)-HLAA2 y que tiene:

(a) una secuencia del dominio variable de la cadena alfa al menos 90 %, al menos 93 % o al menos 94 % idéntica a los aminoácidos 1 a 109 de la SEQ ID No: 2, en la que restos de aminoácidos en una o más de las posiciones 94D, 97L, 98V o 102G están mutados, y una secuencia variable de la cadena beta de aminoácidos 1 a 112 de SEQ ID No: 3 excepto que restos de aminoácidos de una o más de las posiciones 27L, 28N, 29H, 30D, 31A, 50Q, 51I, 52V, 53N, 54D, 61A, 94S, 95I, 96G, 97G, 98P o 100E están mutados; o

(b) una secuencia del dominio variable de la cadena beta de una de las SEQ ID NO: 10-35 y una secuencia del dominio variable de la cadena alfa que es al menos 90 %, al menos 93 %, al menos 94 % o 100 % idéntica a los aminoácidos 1 a 109 de la SEQ ID NO: 2.

Receptores de linfocitos T

La presente invención se refiere a receptores de linfocitos T (TCR) que se unen al péptido YLEPGPVTA (derivado de la proteína gp1) presentado como un complejo de péptido-HLA-A2, teniendo los TCR mutaciones con respecto a los dominios variables alfa y/o beta de TCR gp1. Algunos de dichos TCR tienen afinidades de unión por, y/o semividas de unión por el complejo al menos doble del de un TCR gp1 de referencia.

Antecedentes de la invención

El péptido YLEPGPVTA (SEQ ID No: 1) corresponde a los números de restos de aminoácidos 28-288 de la proteína glicoproteína 1 humana (gp1). Gp1 es expresada amplia y significativamente en exceso en células de cáncer melanoma. Por ejemplo, un estudio (Trefzer y col., (26) Melanoma Res. 16(2): 137-45) encontró que 82% de 192 metástasis de melanomas de 28 pacientes con melanoma expresaban gp1. Varios estudios describieron niveles de expresión mayores de gp1 en tejidos de melanoma (Hofbauer y col., (24) J. Immunother. 27(1): 73-8, Barrowy col., (26) Clin. Cáncer Res. 12:764-71). El péptido YLEPGPVTA (SEQ ID No: 1) es presentado por moléculas HLA de clase 1 en células de cáncer gyp1+ / HLA-A2. (Salgaller y col., (1996) Cáncer Res 56: 4749-4757).

Por lo tanto, el complejo YLEPGPVTA-HLA-A2 proporciona un marcador de cáncer al que pueden dirigirse los TCR de la invención. Por ejemplo, los TCR de la invención se pueden usar con el propósito de suministrar agentes citotóxicos a las células de cáncer, o se pueden transformar en linfocitos T, volviéndolos capaces de destruir células tumorales que presentan este complejo de HLA, para la administración a un paciente en el método del tratamiento conocido como terapia adoptiva. Sin embargo, para el primer propósito sería conveniente que los TCR tuvieran una afinidad considerablemente más alta y/o una velocidad de disociación considerablemente más lenta, de modo que los TCR residan en las células tumorales a las que van dirigidos durante un periodo de tiempo prolongado. Para el último propósito, sería conveniente que los TCR tuvieran una afinidad algo mayor y/o una velocidad de disociación algo más lenta para el complejo de péptido-HLA que los TCR naturales específicos para este complejo, pero no una afinidad tan alta como para el primer propósito. Un aumento notable en la afinidad se ha asociado con una pérdida de especificidad del antígeno en los linfocitos T CD8 modificados por el gen de TCR, lo cual podría producir la activación no específica de estos linfocitos T CD8 transfectados con TCR, de modo que se preferiría la afinidad intermedia de los TCR para la terapia adoptiva (véase Zhao y col., (27) J. Immunol. 179: 5845-54; Robbins y col., (28) J. Immunol. 18: 6116-31; y véase también el documento publicado WO 28/382). La presente invención proporciona dichos TCR.

Los TCR se describen usando la nomenclatura internacional de inmunogenética (IMGT) de TCR y enlaza con la base de datos pública de IMGT de secuencias de TCR. Los TCR heterodímeros alfa-beta naturales tienen una cadena alfa y una cadena beta. En general, cada cadena comprende regiones variables, de unión y constantes, y la cadena beta normalmente también contiene una región diversa corta entre las regiones variables y de unión, pero esta región diversa con frecuencia se considera como parte de la región de unión. Cada región variable comprende 3 CDR (regiones determinantes de la complementariedad) insertadas en una secuencia armazón, siendo una la región hipervariable denominada CD3. Hay varios tipos de regiones variables de la cadena alfa (Va) y varios tipos de regiones variables de la cadena beta (VP) distinguidas por sus secuencias armazón, CDR1 y CDR2, y por una secuencia CDR3 parcialmente definida. Los tipos de Va se denominan en la nomenclatura IMGT por su número TRAV único. Por lo tanto, "TRAV17" define una región Va de TCR que tiene secuencias armazón y de CDR1 y CDR2 únicas, y una secuencia de CDR3 que está parcialmente definida por una secuencia de aminoácidos que se conserva de un TCR a otro TCR, pero que también incluye una secuencia de aminoácidos que varía de un TCR a otro TCR. De la misma forma, "TRBV19" define una región Vp de TCR que tiene secuencias armazón y de CDR1 y CDR2 únicas, pero con una secuencia de CDR3 solo parcialmente definida.

Las regiones de unión del TCR están definidas de forma similar por la nomenclatura IMGT TRAJ y TRBJ, y las regiones constantes por la nomenclatura IMGT TRAC y TRBC.

La región diversa de la cadena beta se denomina en la nomenclatura IMGT por la abreviatura TRBD, y como se ha mencionado, las regiones concatenadas TRBD/TRBJ a menudo se consideran juntas como la región de unión.

Las cadenas a y p de los TCR ap en general se considera que tienen cada una dos "dominios", en concreto dominios variable y constante. El dominio variable consiste en una concatenación de la región variable y la región de unión. Por lo tanto, en la presente memoria descriptiva y las reivindicaciones, la expresión "dominio variable alfa de TCR" se refiere a la concatenación de regiones TRAV y TRAJ, y la expresión dominio constante alfa de TCR se refiere a la región TRAC extracelular o a una secuencia de TRAC truncada C-terminal. Igualmente, la expresión "dominio variable beta de TCR" se refiere a la concentración de regiones TRBV y TRBD/TRBJ, y la expresión dominio constante beta de TCR se refiere a la región TRBC extracelular, o a una secuencia de TRBC truncada C- terminal.

Las secuencias únicas definidas por la nomenclatura IMGT son ampliamente conocidas y están accesibles para los que trabajan en el campo de los TCR. Por ejemplo, se pueden encontrar en la base de datos pública de IMGT. En "T cell Receptor Factsbook", (21) LeFranc and LeFranc, Academic Press, ISBN -12-441352-8, también se describen secuencias definidas por la nomenclatura IMGT, pero debido a su fecha de publicación y el consiguiente retardo de tiempo, a veces es necesario confirmar la información en el mismo por referencia a la base de datos de IMGT.

Los autores de la invención han confirmado que un clon de TCR gp1 natural tiene el siguiente uso de genes V, J y C de la cadena alfa y cadena beta:

Cadena alfa - TRAV17/TRAJ29/TRAC (la secuencia extracelular de la cadena alfa de TCR gp1 natural se da en la SEQ ID No: 2.

Cadena beta: - TRBV19*1/TRBD1/TRBJ2-7*1/TRBC2 (la secuencia extracelular de la cadena beta de TCR gp1 natural se da en la SEQ ID No: 3. (Obsérvese que la secuencia de TRBV19 tiene 3 variantes alélicas, designadas en la nomenclatura IMGT TRBV19*1, *2 y *3 respectivamente, y el clon de TCR gp1 natural al que se ha hecho referencia anteriormente tiene la variación *1. De la misma forma, la secuencia de TRBJ2-7 tiene dos variaciones conocidas y es la secuencia *1 la que está presente en el clon de TCR referido anteriormente. Obsérvese también que la ausencia de un calificador "*" significa que solo se conoce un alelo para la secuencia relevante).

Las expresiones "TCR de tipo natural", "TCR natural", "TCR gp1 de tipo natural" y "TCR gp1 natural" se usan de forma sinónima en el presente documento para referirse a este TCR que se encuentra de forma natural que tiene la cadena alfa y beta extracelular de SEQ ID No: 2 y 3.

Los documentos WO 99/612, WO 3/2763, WO 24/4841, WO 26/5496 y EP 1795599 describen receptores de linfocitos T con diferentes especificidades y/o secuencias variables.

Breve descripción de la invención

De acuerdo con la invención, se proporciona un receptor celular (TCR) que tiene la propiedad de unirse al complejo YLEPGPVTA (SEQ ID No: 1)-HLA-A2 y que tiene (a) una secuencia del dominio variable de la cadena alfa al menos 9 %, al menos 93 % o al menos 94 % idéntica a los aminoácidos 1 a 19 de la SEQ ID No: 2, en la que los restos de aminoácidos en una o más de las posiciones 94D, 97L, 98V o 12G han mutado, y una secuencia variable de la cadena beta de aminoácidos 1 a 112 de SEQ ID No: 3 excepto que los restos de aminoácidos de una o más de las posiciones 27L, 28N, 29H, 3D, 31 A, 5Q, 511, 52V, 53N, 54D, 61 A, 94S, 95I, 96G, 97G, 98P o 1E han mutado; o (b) una secuencia del dominio variable de la cadena beta de una de las SEQ ID NO: 1-35 y una secuencia del dominio variable de la cadena alfa que es al menos 9 %, al menos 93 %, al menos 94 % o 1% idéntica a los aminoácidos 1 a 19 de la SEQ ID NO: 2.

En una realización, el TCR tiene una afinidad de unión por, y/o una semivida de unión por el complejo de YLEPGPVTA-HLA-A2 al menos doble que un TCR gp1 de referencia, teniendo dicho TCR gp1 de referencia la secuencia de la cadena alfa extracelular de SEQ ID No: 45 y la secuencia de la cadena beta extracelular de SEQ ID No: 46.

Obsérvese que la SEQ ID No: 45 es la secuencia ID No: 2 extracelular... [Seguir leyendo]

1. Un receptor de linfocitos T (TCR) que tiene la propiedad de unirse al complejo YLEPGPVTA (SEQ ID No: 1)-HLA- A2 y que tiene:

(a) una secuencia del dominio variable de la cadena alfa al menos 9 %, al menos 93 % o al menos 94 % idéntica a los aminoácidos 1 a 19 de la SEQ ID No: 2, en la que restos de aminoácidos en una o más de las posiciones 94D, 97L, 98V o 12G están mutados, y una secuencia variable de la cadena beta de aminoácidos 1 a 112 de SEQ ID No: 3 excepto que restos de aminoácidos de una o más de las posiciones 27L, 28N, 29H, 3D, 31 A, 5Q, 511, 52V, 53N, 54D, 61 A, 94S, 95I, 96G, 97G, 98P o 1E están mutados; o

(b) una secuencia del dominio variable de la cadena beta de una de las SEQ ID NO: 1-35 y una secuencia del dominio variable de la cadena alfa que es al menos 9 %, al menos 93 %, al menos 94 % o 1 % idéntica a los aminoácidos 1 a 19 de la SEQ ID NO: 2.

2. Un TCR según la reivindicación 1 (b), en el que la secuencia del dominio variable de la cadena alfa es al menos 9 %, al menos 93 % o al menos 94 % idéntica a los aminoácidos 1 a 19 de la SEQ ID No: 2, en la que restos de aminoácidos en una o más de las posiciones 94D, 97L, 98V o 12G están mutados.

3. Un TCR según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, que tiene una afinidad de unión por y/o una semivida de unión por el complejo YLEPGPVTA-HLA-A2 al menos doble que la de un TCR que tiene la secuencia de la cadena alfa extracelular de SEQ ID NO: 45 y la secuencia de la cadena beta extracelular de SEQ ID NO: 46.

4. Un TCR según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende una o más de las siguientes mutaciones de aminoácidos del dominio variable de la cadena alfa 94S, 94T, 94R, 97M, 98M, 98Q, 98G, 98S, 98A o 12D usando la numeración mostrada en la SEQ ID No: 2.

5. Un TCR según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende una o más de las siguientes mutaciones de aminoácidos del dominio variable de la cadena beta 27I, 28F, 29Q, 3K, 31K, 5W, 51 A, 51G, 52Q, 52Y, 52T, 53G, 53F, 54N, 54H, 61T, 94L, 95Y, 95H, 95W, 95F, 95S, 95V, 96C, 97E, 97A, 98G, 1Q o 1P usando la numeración mostrada en la SEQ ID No: 3.

6. Un TCR según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende una de las secuencias de aminoácidos del dominio variable de la cadena alfa de SEQ ID No: 7, 8 y 9.

7. Un TCR según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende una de las secuencias de aminoácidos del dominio variable de la cadena beta de SEQ ID No: 1, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 2, 21, 22,

23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 3, 31, 32, 33, 34 y 35.

8. Un TCR según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que es un TCR heterodímero a(3, y que tiene secuencias del dominio constante de las cadenas alfa y beta en los que la Thr 48 de TRAC y la Ser 57 de TRBC1 o TRBC2 están mutadas ambas en clsteína, formando dichas cisternas un enlace disulfuro entre los dominios constantes alfa y beta del TCR.

9. Un TCR según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que es un TCR heterodímero a|3, y que tiene secuencias del dominio constante de las cadenas alfa y beta en las que las secuencias del dominio constante están unidas por el enlace disulfuro natural entre la Cys4 del exón 2 de TRAC y la Cys2 del exón 2 de TRBC1 o TRBC2.

1. Un TCR según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que está asociado con un marcador detectable, un agente terapéutico, un resto modificador de la PK o una combinación de cualquiera de estos.

11. Un TCR según la reivindicación 1, en el que el agente terapéutico es un anticuerpo dirigido contra CD3 unido covalentemente al extremo C o N de la cadena alfa o beta del TCR.

12. Un complejo de TCR multlvalente que comprende al menos dos TCR según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes.

13. ADN o ARN que codifican un TCR según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11.

14. Una célula aislada que presenta un TCR según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.

15. Un TCR según la reivindicación 11, que comprende:

una secuencia de aminoácidos de la cadena alfa del TCR seleccionada del grupo que consiste en:

(I) la secuencia de la cadena alfa del TCR de SEQ ID No: 45, en la que los aminoácidos 1 a 19 se sustituyen por la

secuencia SEQ ID No: 8, en la que el aminoácido en la posición 1 es S;

(¡i) la secuencia de la cadena alfa del TCR de SEQ ID No: 45, en la que los aminoácidos 1 a 19 se sustituyen por la secuencia SEQ ID No: 8, en la que el aminoácido en la posición 1 es A;

(¡II) la secuencia de la cadena alfa del TCR de SEQ ID No: 45, en la que los aminoácidos 1 a 19 se sustituyen por la secuencia SEQ ID No: 8, en la que el aminoácido en la posición 1 es G;

(¡v) la secuencia de la cadena alfa del TCR de SEQ ID No: 45, en la que los aminoácidos 1 a 19 se sustituyen por la secuencia SEQ ID No: 8, en la que el aminoácido en la posición 1 es S, y el extremo C de la cadena alfa está truncado en 8 aminoácidos desde F196 a S23 incluido, basado en la numeración de la SEQ ID No: 45;

(v) la secuencia de la cadena alfa del TCR de SEQ ID No: 45, en la que los aminoácidos 1 a 19 se sustituyen por la secuencia SEQ ID No: 8, en la que el aminoácido en la posición 1 es A, y el extremo C de la cadena alfa está truncado en 8 aminoácidos desde F196 a S23 incluido, basado en la numeración de la SEQ ID No: 45;

(vi) la secuencia de la cadena alfa del TCR de SEQ ID No: 45, en la que los aminoácidos 1 a 19 se sustituyen por la secuencia SEQ ID No: 8, en la que el aminoácido en la posición 1 es G, y el extremo C de la cadena alfa está truncado en 8 aminoácidos desde F196 a S23 incluido, basado en la numeración de la SEQ ID No: 45;

y una secuencia de aminoácidos de la cadena beta del TCR-anti-CD3 seleccionada del grupo que consiste en:

(vii) la secuencia de la cadena beta de TCR-anti-CD3 de SEQ ID No: 36, en la que los aminoácidos en las posiciones 1 y 2 son D e I respectivamente;

(viii) la secuencia de la cadena beta de TCR-anti-CD3 de SEQ ID No: 36, en la que los aminoácidos en las posiciones 1 y 2 son A e I respectivamente;

(ix) la secuencia de la cadena beta de TCR-anti-CD3 de SEQ ID No: 36, en la que los aminoácidos en las posiciones 1 y 2 son A y Q respectivamente;

(x) la secuencia de la cadena beta de TCR-anti-CD3 de SEQ ID No: 36, en la que los aminoácidos en las posiciones 1 y 2 son D e I respectivamente, los aminoácidos en las posiciones 18-131 se sustituyen por la SEQ ID No: 44, y los aminoácidos en las posiciones 254-258 se sustituyen por la SEQ ID No: 47;

(xi) la secuencia de la cadena beta de TCR-anti-CD3 de SEQ ID No: 36, en la que los aminoácidos en las posiciones 1 y 2 son D e I respectivamente y el aminoácido en la posición 257 es una S y el aminoácido en la posición 258 es una G;

(xii) la secuencia de la cadena beta de TCR-anti-CD3 de SEQ ID No: 36, en la que los aminoácidos en las

posiciones 1 y 2 son D e I respectivamente y el aminoácido en la posición 256 es una S y el aminoácido en la

posición 258 es una G;

(xiii) la secuencia de la cadena beta de TCR-anti-CD3 de SEQ ID No: 36, en la que los aminoácidos en las

posiciones 1 y 2 son D e I respectivamente y el aminoácido en la posición 255 es una S y el aminoácido en la

posición 258 es una G;

(xiv) una cadena beta de TCR-anti-CD3 que tiene la secuencia SEQ ID No: 36, en la que los aminoácidos en las posiciones 1 y 2 son A y Q, y en la que el aminoácido en la posición 257 es una S y el aminoácido en la posición 258 es una G.

(xv) una cadena beta de TCR-anti-CD3 que tiene la secuencia SEQ ID No: 36, en la que los aminoácidos en las posiciones 1 y 2 son A y Q, y en la que el aminoácido en la posición 256 es una S y el aminoácido en la posición 258 es una G;

(xvi) una cadena beta de TCR-anti-CD3 que tiene la secuencia SEQ ID No: 36, en la que los aminoácidos en las posiciones 1 y 2 son Ay Q, y en la que el aminoácido en la posición 255 es una S y el aminoácido en la posición 258 es una G;

(xvii) y una cadena beta de TCR-anti-CD3 que tiene la secuencia SEQ ID No: 36, en la que los aminoácidos en las posiciones 1 y 2 son A e I respectivamente, y en la que el aminoácido en la posición 257 es una S y el aminoácido en la posición 258 es una G;

(xviii) una cadena beta de TCR-anti-CD3 que tiene la secuencia SEQ ID No: 36, en la que los aminoácidos en las posiciones 1 y 2 son A e I respectivamente, y en la que el aminoácido en la posición 256 es una S y el aminoácido en la posición 258 es una G;

(xix) una cadena beta de TCR-anti-CD3 que tiene la secuencia SEQ ID No: 36, en la que los aminoácidos en las posiciones 1 y 2 son A e I respectivamente, y en la que el aminoácido en la posición 255 es una S y el aminoácido en la posición 258 es una G;

16. Un TCR según la reivindicación 15, en el que

a secuencia de aminoácidos de la cadena alfa es (i) y la secuencia de aminoácidos de la cadena beta-anti-CD3 es

(vü);

a secuencia de aminoácidos de la cadena alfa es (i) y la secuencia de aminoácidos de la cadena beta-anti-CD3 es

(X);

a secuencia de aminoácidos de la cadena alfa es (vi) y la secuencia de aminoácidos de la cadena beta-anti-CD3 es

(¡x);

a secuencia de aminoácidos de la cadena alfa es (v) y la secuencia de aminoácidos de la cadena beta-antl-CD3 es

(viü);

a secuencia de aminoácidos de la cadena alfa es (vi) y la secuencia de aminoácidos de la cadena beta-antl-CD3 es

(vü);

a secuencia de aminoácidos de la cadena alfa es (i) y la secuencia de aminoácidos de la cadena beta-anti-CD3 es

(x¡);

a secuencia de aminoácidos de la cadena alfa es (i) y la secuencia de aminoácidos de la cadena beta-anti-CD3 es

(xü);

a secuencia de aminoácidos de la cadena alfa es (i) y la secuencia de aminoácidos de la cadena beta-anti-CD3 es

(xüi);

a secuencia de aminoácidos de la cadena alfa es (vi) y la secuencia de aminoácidos de la cadena beta-antl-CD3 es

(xiv) ;

a secuencia de aminoácidos de la cadena alfa es (vi) y la secuencia de aminoácidos de la cadena beta-antl-CD3 es

(xv) ;

a secuencia de aminoácidos de la cadena alfa es (vi) y la secuencia de aminoácidos de la cadena beta-antl-CD3 es

(xvi) ;

a secuencia de aminoácidos de la cadena alfa es (v) y la secuencia de aminoácidos de la cadena beta-anti-CD3 es

(xvii) ;

a secuencia de aminoácidos de la cadena alfa es (v) y la secuencia de aminoácidos de la cadena beta-anti-CD3 es

(xviii) ;

a secuencia de aminoácidos de la cadena alfa es (v) y la secuencia de aminoácidos de la cadena beta-anti-CD3 es

(xix) ;

a secuencia de aminoácidos de la cadena alfa es (vi) y la secuencia de aminoácidos de la cadena beta-antl-CD3 es

(xi);

a secuencia de aminoácidos de la cadena alfa es (vi) y la secuencia de aminoácidos de la cadena beta-antl-CD3 es

(xü); y

a secuencia de aminoácidos de la cadena alfa es (vi) y la secuencia de aminoácidos de la cadena beta-antl-CD3 es

(xi¡¡).