Células madre derivadas del cuerpo carotídeo y usos de las mismas caracterizadas porque son positivas para el marcador fenotípico GFAP (proteína acídica fibrilar de origen glial) y negativas para los marcadores fenotípicos TH (tirosina hidroxilasa) y nestina.

Estas células madre pueden proliferar, autorenovarse y diferenciarse a células progenitoras y diferenciadas. Dichas células madre, progenitoras y diferenciadas pueden ser utilizadas en el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas tales como la enfermedad de Alzheimer o la enfermedad de Parkinson

Células madre derivadas del cuerpo carotídeo y usos de las mismas.

Campo de la invención

La presente invención se relaciona con el aislamiento y caracterización de células madre derivadas del cuerpo carotídeo (CC), a métodos para su expansión y diferenciación, y a sus potenciales aplicaciones tanto en investigación como en terapia, por ejemplo, en el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas tales como la enfermedad de Alzheimer o la enfermedad de Parkinson.

Antecedentes de la invención

El uso de células neurales o paraneurales que segregan neurotransmisores, neuromoduladores o enzimas, se ha empleado para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas, siendo una terapia alternativa a la farmacológica. Estas células se han utilizado a nivel experimental, aunque con éxito limitado hasta ahora, en ensayos clínicos.

A finales de los anos setenta y principios de los ochenta se observó el efecto beneficioso de transplantes intraestriatales de médula adrenal, que posee células cromafines secretoras de dopamina, en modelos de Parkinson experimental en ratas.

En los años ochenta se investigó el efecto terapéutico de los autotransplantes paraneurales de médula adrenal en enfermos de Parkinson. Estos transplantes han demostrado poca funcionalidad y un rechazo temprano. A principios de los años ochenta se observó el efecto beneficioso de transplantes de células neurales obtenidas de sustancia negra fetal, utilizando el modelo de Parkinson experimental en roedores. La funcionalidad y supervivencia de estos transplantes es mejor que la de los de transplantes de células cromafines adrenales, pero su uso clínico está muy limitado a ciertos países debido a criterios éticos o legales. Además, los resultados obtenidos en ensayos realizados a doble ciego en pacientes, son menos favorables que lo esperado y en algunos casos el implante de células fetales produce complicaciones motoras indeseables. Se está ensayando a nivel clínico el uso de xenotransplantes con células fetales de sustancia negra no humana, como por ejemplo del cerdo. Esta tecnología presenta, no obstante, limitaciones muy importantes tales como el fuerte rechazo inmunológico y la posible transferencia de agentes infecciosos patógenos entre especies.

A finales de los noventa se pusieron a punto agregados de células glómicas de cuerpo carotídeo para el tratamiento del Parkinson en modelos de la enfermedad en roedores (Espejo et al., 1998; Neuron 20, 197-206). Posteriormente se confirmó que la técnica era factible en un modelo superior de primates (Luquin et al., 1999; Neuron 22, 743-750). Finalmente se llevaron a cabo los primeros ensayos clínicos con pacientes de Parkinson (Arjona et al., 2003; Neurosurgery 53, 321-328), donde la mejoría fue siempre parcial debido probable y principalmente al poco tejido glómico del que se partía.

La terapia celular, basada en el principio de la capacidad regenerativa de células dopaminérgicas a partir de la aplicación de células madre, constituye una vía terapéutica prometedora en el tratamiento de las enfermedades neurodegenrativas. Uno de los objetivos principales que persigue la investigación en este campo consiste en identificar el tipo óptimo de célula madre que pueda ser aplicado con seguridad y eficacia en el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas. El tipo de célula madre idóneo para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas debería ser capaz de expandirse suficientemente, presentar capacidad de diferenciación a células específicas (e.g., células dopaminérgicas) plenamente funcional, integrarse en el tejido nervioso estableciendo eventualmente, aunque no necesariamente, contacto electroquímico con las células adyacentes, y, por último, no estar limitada su aplicación por cuestiones de rechazo inmunológico ni por consideraciones éticas.

En este sentido, la solicitud de patente norteamericana US 2003/0095956 describe el empleo de una población de células neurales no diferenciadas que comprende células con un fenotipo GFAP-/nestina+, procedentes de cerebro y estriado de embriones de ratón y de tejido cerebral de ratón juvenil y adulto potencialmente útiles en el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas, e.g., Parkinson. No obstante, estas células son diferentes de las células nestina+ proporcionadas por la presente invención, ya que estas últimas proceden del cuerpo carotídeo (y no del cerebro o del estriado) y presentan la propiedad de diferenciarse a células glómicas (TH+ y sensibles a hipoxia e hipoglucemia), propiedad que no tienen los precursores nestina+ aislados del cerebro o del estriado. Asimismo, la solicitud de patente internacional WO 00/29549 describe un método para cultivar células madre de la cresta neural (NCSC) que comprende cultivar dichas NCSC bajo condiciones de hipoxia; dichas NCSC son potencialmente útiles en el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas asociadas con la deficiencia en un neurotransmisor, e.g., la enfermedad de Parkinson o la enfermedad de Alzheimer. Las células proporcionadas por esta invención son células diferentes a las definidas en dicha solicitud de patente WO 00/29549; además, en esta invención se usa la hipoxia para estimular la proliferación de las células del CC porque se sabe desde hace mucho tiempo que la hipoxia estimula el crecimiento del CC in vivo.

Aunque se ha avanzado mucho en el conocimiento sobre el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas mediante terapia celular, todavía no se ha encontrado una población de células madre adultas que pueda ser usada con seguridad y eficacia en el tratamiento de dichas enfermedades neurodegenerativas. Dicha población celular proporcionaría un método simple y eficaz de reparar los daños causados por las enfermedades neurodegenerativas. Por tanto, sigue existiendo la necesidad de mejorar la eficacia de las terapias existentes, así como la búsqueda de alternativas que puedan restaurar el daño causado por las enfermedades neurodegenerativas.

Adicionalmente, sigue existiendo la necesidad de aislar, cultivar, mantener, propagar y diferenciar células madre adultas para desarrollar tipos celulares destinados a distintas aplicaciones. Dichas aplicaciones pueden incluir el uso de células madre autólogas para tratar enfermedades, por ejemplo, enfermedades neurodegenerativas, cardíacas, etc.

Compendio de la invención

Ahora, los inventores han descubierto, sorprendentemente, la presencia de células madre en el sistema nervioso periférico (SNP) adulto, más concretamente, en el cuerpo carotídeo (CC). Dichas células madre adultas, al contrario de lo que se podía pensar inicialmente, no son las células glómicas (o tipo I), sino las células sustentaculares o tipo II. Tal como se muestra en los ejemplos de esta descripción, dichas células madre adultas tienen la capacidad de dividirse (proliferación), renovarse a sí mismas a través de la división celular durante largos periodos de tiempo (auto-renovación) y, bajo ciertas condiciones fisiológicas o experimentales, la capacidad de ser inducidas a diferenciarse en otros tipos de células diferenciadas específicas (diferenciación). Además, los inventores han desarrollado un método in vitro para la expansión del CC que permite obtener agregados celulares capaces de expresar y segregar factores tróficos, neurotransmisores, neuromoduladores, enzimas, etc. Los transplantes con dichas células madre adultas o agregados celulares obtenidos por dicho método de expansión podrían ser de utilidad en clínica, en particular, en la terapia de enfermedades neurodegenerativas.

Como se ha mencionado previamente en los Antecedentes de la Invención, los auto-transplantes con células procedentes del cuerpo carotídeo para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas son conocidos, ya que se sabe que en estas patologías el déficit de algunas moléculas (por ejemplo, neurotransmisores, factores de crecimiento, etc.) puede ser compensado mediante la implantación de células capaces de expresar y secretar dichas moléculas. En cualquier caso, los auto-transplantes con células glómicas procedentes del CC han resultado insuficientes para paliar los danos provocados por enfermedades, tales como la enfermedad de Alzheimer o de Parkinson, por lo que es preciso mejorar dichos tratamientos o encontrar alternativas a los mismos. Los experimentos que más adelante se detallan muestran cómo las células glómicas, obtenidas por el método proporcionado por esta invención, unido al hecho de ser capaces de obtener una mayor cantidad de las mismas, permite mejorar las metodologías de tratamiento por auto-transplante...

1. Una célula madre adulta aislada, procedente del cuerpo carotídeo, caracterizada porque es positiva para el marcador fenotípico GFAP (proteína acídica fibrilar de origen glial) y negativa para los marcadores fenotípicos TH (tirosina hidroxilasa) y nestina.

2. Una célula progenitora adulta, aislada, derivada de dicha célula madre según la reivindicación 1, caracterizada porque es positiva para el marcador fenotípico nestina.

3. Célula progenitora según la reivindicación 2, caracterizada porque es débilmente positiva para el marcador GFAP y positiva para el marcador fenotípico nestina.

4. Célula progenitora según la reivindicación 2, caracterizada porque es negativa para el marcador GFAP y positiva para el marcador fenotípico nestina.

5. Una célula diferenciada, adulta, derivada de dicha célula madre según la reivindicación 1 o de dicha célula progenitora según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, caracterizada porque es negativa para el marcador fenotípico nestina y es positiva para un marcador de especialización.

6. Célula diferenciada según la reivindicación 5, en la que dicho marcador de especialización es la tirosina hidroxilasa (TH).

7. Célula diferenciada según la reivindicación 5, en la que dicho marcador de especialización es la actina de músculo liso (SMA).

8. Célula según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizada porque ha sido manipulada genética- mente.

9. Una célula inmortalizada de forma reversible, caracterizada porque dicha célula se selecciona del grupo formado por una célula madre según la reivindicación 1, una célula progenitora según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, y una célula diferenciada según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5.

10. Célula según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, de origen humano.

11. Una población, aislada, de células derivadas del cuerpo carotídeo que comprende un conjunto de células según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 o combinaciones de las mismas.

12. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de células según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 o combinaciones de las mismas, o de una población celular según la reivindicación 11, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

13. Uso de células según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 o combinaciones de las mismas, o de una población celular según la reivindicación 11, en la elaboración de una composición farmacéutica para el tratamiento de una enfermedad neurodegenerativa, en el tratamiento de lesiones isquémicas del sistema nervioso, en el tratamiento de lesiones traumáticas del sistema nervioso, o en el tratamiento de lesiones autoinmunes del sistema nervioso.

14. Uso según la reivindicación 13, en el que dicha enfermedad neurodegenerativa es la enfermedad de Alzheimer o la enfermedad de Parkinson.

15. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 13 ó 14, en el que dichas células son células glómicas (nestina-/TH+) de novo, derivadas de dicha célula madre según la reivindicación 1 o de dicha célula progenitora según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4.

16. Uso según la reivindicación 15, en el que dichas células glómicas de novo, en forma de neuroesferas.

17. Un método para la expansión de células madre según la reivindicación 1 o de células progenitoras según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, que comprende cultivar dichas células madre o progenitoras bajo condiciones de hipoxia en un medio de cultivo específico para la cresta neural.

18. Método según la reivindicación 17, en el que dichas células madre o progenitoras son cultivadas en una superficie no adherente.

19. Método según la reivindicación 17, en el que dicho medio de cultivo específico para la cresta neural comprende un medio de cultivo, una fuente de nutrientes, antibióticos y un factor de crecimiento.

20. Método según la reivindicación 19, en el que dicho factor de crecimiento se selecciona entre un factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) o una variante funcional del mismo, un factor de crecimiento de tipo insulina tipo I (IGF-I) o una variante funcional del mismo, un factor de crecimiento epidérmico (EGF) o una variante del mismo, y una combinación de dichos factores.

21. Método según la reivindicación 17, en el que el cultivo de dichas células madre o progenitoras se lleva a cabo en presencia de una concentración de oxígeno inferior al 15%, preferentemente entre 1-10%, más preferentemente entre 2-5% y aun más preferentemente del 3%.

22. Un método para evaluar in vitro la respuesta celular a un compuesto potencialmente terapéutico que comprende poner en contacto un cultivo que comprende células según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, con un compuesto potencialmente terapéutico y evaluar los efectos causados por dicho compuesto sobre las células presentes en dicho cultivo.