AMPLICON CPG Y PROTOCOLO DE MATRICES.
Método de análisis del estado de metilación de una o más secuencias de nucleótidos que comprende las etapas de:
a) seleccionar una o más secuencias genómicas de nucleótidos de prueba de uno o más sujetos que presentan un fenotipo de interés, y una o más secuencias genómicas de control correspondientes de uno o más sujetos de control que carecen del fenotipo de interés;
b) digerir las secuencias genómicas de nucleótidos de prueba y digerir por separado las secuencias genómicas de control con una o más endonucleasas de restricción sensibles a metilación, para producir extremos que pueden ligarse a una secuencia de nucleótidos de adaptador;
c) ligar las secuencias de nucleótidos de adaptador a los extremos producidos en la etapa b) para producir secuencias ligadas;
d) escindir las secuencias ligadas con una o más endonucleasas específicas de metilación escindiendo sólo secuencias de nucleótidos metilados, para producir secuencias de nucleótidos de prueba amplificables, secuencias de nucleótidos de prueba no amplificables, secuencias de nucleótidos de control amplificables y secuencias de nucleótidos de control no amplificables;
e) amplificar las secuencias de nucleótidos de prueba amplificables y las secuencias de nucleótidos de control amplificables para producir secuencias de nucleótidos de prueba amplificadas y secuencias de nucleótidos de control amplificadas;
f) marcar las secuencias de nucleótidos de prueba amplificadas de la etapa e) con un primer marcador, y marcar las secuencias de nucleótidos de control amplificadas de la etapa e) con un segundo marcador;
g) hibridar los productos marcados de la etapa f) con una matriz que comprende una serie de secuencias de nucleótidos que pueden hibridar con los mismos; y
h) determinar la razón de las señales emitidas por el primer marcador en relación con el segundo marcador para cada secuencia de nucleótidos hibridada en la matriz
Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/CA2005/000211.
Solicitante: CENTRE FOR ADDICTION AND MENTAL HEALTH.
Nacionalidad solicitante: Canadá.
Dirección: 33 RUSSELL STREET,TORONTO, ON M5S 2S1.
Inventor/es: PETRONIS,ARTURAS, SCHUMACHER,AXEL.
Fecha de Publicación: .
Fecha Concesión Europea: 14 de Abril de 2010.
Clasificación Internacional de Patentes:
- C12Q1/68D2G
Clasificación PCT:
- C12P19/34 QUIMICA; METALURGIA. › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12P PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN ENZIMAS PARA LA SINTESIS DE UN COMPUESTO QUIMICO DADO O DE UNA COMPOSICION DADA, O PARA LA SEPARACION DE ISOMEROS OPTICOS A PARTIR DE UNA MEZCLA RACEMICA. › C12P 19/00 Preparación de compuestos que contienen radicales sacárido (ácido cetoaldónico C12P 7/58). › Polinucleótidos, p. ej. ácidos nucleicos, oligorribonucleótidos.
- C12Q1/68 C12 […] › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que intervienen ácidos nucleicos.
Clasificación antigua:
![AMPLICON CPG Y PROTOCOLO DE MATRICES.](https://patentados.com/img/2010/08/amplicon-cpg-y-protocolo-de-matrices.jpg)
Fragmento de la descripción:
Amplicón CpG y protocolo de matrices.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a métodos y sistemas para elaborar perfiles epigéneticos. Más específicamente, la presente invención se refiere a métodos y sistemas para evaluar los niveles de metilación de secuencias de nucleóti-dos.
Antecedentes de la invención
Muchas líneas de pruebas han mostrado que la modificación de las bases de citosina que se encuentran en la secuencia dinucleotídica CpG en genomas de vertebrados desempeña un papel esencial en la regulación de una variedad de funciones del genoma tales como inactivación del cromosoma X, impronta parental, inactivación de retroelementos genómicos y expresión génica diferencial. En todo el genoma humano, aproximadamente el 80% de los dinucleótidos CpG están fuertemente metilados, aunque algunas zonas permanecen no metiladas, preferentemente en las islas CpG ricas en GC [Bird, A.P., CpG-rich islands and the function of DNA methylation. Nature, 1986. 321(6067): págs. 209-13]. La metilación del ADN puede realizar su función reguladora a través del marcaje diferencial de genes. La metilación de la citosina es un proceso estable pero potencialmente reversible que permite la regulación específica espacial y temporal de genes en organismos superiores.
Se han aplicado varias estrategias diferentes para detectar dinucleótidos CpG metilados en genomas eucariotas (revisadas en [van Steensel, B. y S. Henikdef, Epigenomic profiling using microarrays. Biotechniques, 2003. 35(2): págs. 346-50, 352-4, 356-7]). El método más frecuentemente usado es la estrategia basada en la modificación con bisulfito, desarrollada por Frommer et al. [Frommer, M., et al., A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands. Proc Natl Acad Sci U S A, 1992. 89(5): págs. 1827-31]. En este método, el bisulfito convierte las bases de citosina no metiladas en uracilo, mientras las citosinas metiladas permanecen inalteradas. Pueden secuenciarse directamente tales secuencias usando el método de secuenciación de Sanger o pueden examinarse usando micromatrices. En tales micromatrices, los pares de oligonucleotidos que difieren por tener o bien una citosina o bien una timina en una posición que puede metilarse de una citosina, pueden discriminar los dos nucleótidos incubando a una temperatura que permite sólo emparejamientos exactos entra la sonda y el oligonucleótido, Adorjan, P., et al., Tumour class prediction and discovery by microarray-based DNA methylation analysis. Nucleic Acids Res, 2002. 30(5): p. e21; Gitan, R.S., et al., Methylation-specific oligonucleotide microarray: a new potential for high-throughput methylation analysis. Genome Res, 2002. 12(1): págs. 158-64; Balog, R.P., et al., Parallel assessment of CpG methylation by two-color hybridization with oligonucleotide arrays. Anal Biochem, 2002. 309(2): págs. 301-10; Hou, P., et al., A microarray to analyze methylation patterns of p16(Enk4a) gene 5'-CpG islands. Clin Biochem, 2003. 36(3): págs. 197-202.
Se han publicado varios otros métodos para proporcionar el estado de metilación en una escala global incluyendo experimentos con micromatrices. En un método denominado hibridación de metilación diferencial (DMH) [Huang, T.H., documento US 6.605.432 B1 expedido el 12 de agosto de 2003.], se trató ADN genómico (ADNg) de células de cáncer de mama con el cortador de cuatro bases MseI que restringe el ADNg en fragmentos pequeños de 100-200 pb. Esta enzima raramente corta en regiones ricas en CpG, dejando muchas islas CpG intactas. La escisión mediante MseI va seguida por el ligamiento de adaptadores de extremos específicos para extremos cohesivos de MseI, la escisión con la enzima BstUI sensible a metilación y la posterior amplificación por PCR. Este método da como resultado la amplificación de la fracción hipermetilada de ADNg, e ignora la fracción hipometilada o no metilada.
Las micromatrices en este estudio contienen fragmentos de ADN que representan diversas islas CpG. Varias otras publicaciones usaron la etapa de enriquecimiento para la fracción hipermetilada de un genoma dado [Yan, P.S., et al., Applications of CpG island microarrays for high-throughput analysis of DNA methylation. J Nutr, 2002. 132(Supl. 8): págs. 2430S-2434S; Yan, P.S., et al., Use of CpG island microarrays to identify colorectal tumors with a high degree of concurrent methylation. Methods, 2002. 27(2): págs. 162-9; Shi, H., et al., Triple analysis of the cancer epigenome: an integrated microarray system for assessing gene expression, DNA methylation, and histone acetylation. Cancer Res, 2003. 63(9): págs. 2164-71; Toyota, M., et al., Identification of differentially methylated sequences in colorectal cancer by methylated CpG island amplification. Cancer Res, 1999. 59(10): págs. 2307-12; Yan, P.S., et al., Dissecting complex epigenetic alterations in breast cancer using CpG island microarrays. Cancer Res, 2001. 61(23): págs. 8375-80]. La amplificación de las secuencias no metiladas se suprime mediante la digestión del ADN molde antes de PER con las enzimas de restricción BstUI y HpaII, que se bloquean mediante la metilación de su secuencia diana [Yan, P.S., et al., Dissecting complex epigenetic alterations in breast cancer using CpG island microarrays. Cancer Res, 2001. 61(23): págs. 8375-80.]. Se usó la fracción de ADN hipermetilada resultante para comparar los patrones de metilación del tumor y tejidos control hibridando con micromatrices que contenían fragmentos genómicos clonados aleatoriamente que estaban enriquecidos en islas CpG.
Un método relacionado usa una etapa de digestión con SnaiI, seguido por digestión con XmaI, que es un isoesquizómero insensible a metilo de SmaI [Hatada, I., et al., A microarray-based method for detecting methylated loci. J Hum Genet, 2002. 47(8): págs. 448-51.]. La escisión con SmaI produce un fragmento de ADN de extremos romos, mientras que los productos de escisión de XmaI contienen extremos salientes, que se ligan a adaptadores de XmaI específicos. Tras un PCR que usa cebadores específicos para estos adaptadores, los productos de amplificación resultantes, que consisten principalmente en secuencias 5'-CCCGGG-3' metiladas, se hibridan con micromatrices.
Se presentó otro método que usa enzimas de restricción sensibles a metilación para fraccionar ADN por Tompa et al. [Tompa, R., et al., Genome-wide profiling of DNA methylation reveals transposon targets of CHROMOMETHYLASE3. Curr Biol, 2002. 12(1): págs. 65-8.]. Esta estrategia usó la enzima sensible a metilación MspI, que escinde 5'CCGG-3' pero se bloquea mediante la metilación de la citosina externa (m5'-CCGG-3'). Se fraccionaron por tamaño las muestras de ADN digeridas en gradientes de sacarosa (5%-30%) mediante ultracentrifugación tal como se describió anteriormente [van Steensel, B., J. Delrow, y S. Henikdef, Chromatin profiling using targeted ADN adenine methyltransferase. Nat Genet, 2001. 27(3): págs. 304-8.]. Las fracciones de gradientes que contienen fragmentos de ADN vegetal menores de 2,5 kb, tal como se determinó mediante electroforesis en gel, se reunieron y se concentraron mediante precipitación con isopropanol. Entonces se marcaron las muestras de control y prueba con Cy3- o Cy5-dCTP mediante cebado aleatorio y se hibridaron conjuntamente con micromatrices que contenían productos de amplificación por PCR en puntos que representaban principalmente ubicaciones aleatoriamente elegidas del genoma de Arabidopsis [Tompa, R., et al., Genome-wide profiling of DNA methylation reveals transposon targets of CHROMOMETHYLASE3. Curr Biol, 2002. 12(1): págs. 65-8].
Wang (documento WO 03/027259, publicado el 3 de abril de 2003) da a conocer la escisión del ADN genómico del ratón con la enzima sensible a metilo HpaII, ligamiento de adaptadores específicos para extremos cohesivos de HpaII y PCR usando cebadores marcados con Cy-3 o Cy-5. Los amplicones producidos mediante este método pueden retener secuencias metiladas que están entremedias de los sitios de restricción de HpaII escindidos.
Martienssen et al. (Documento US 2004/0132048, publicado el 8 de julio de 2004) sugiere métodos para obtener fracciones metiladas o no metiladas de ADN genómico obtenido mediante la escisión con enzimas dependientes de metilo tales como McrBC que escinde específicamente secuencias metiladas, o mediante la escisión con, por ejemplo, HpaII que no escinde...
Reivindicaciones:
1. Método de análisis del estado de metilación de una o más secuencias de nucleótidos que comprende las etapas de:
2. Método según la reivindicación 1, que comprende además una etapa de corrección para el efecto de la variación de la secuencia de ADN en el análisis del estado de metilación según la reivindicación 1:
3. Método según la reivindicación 2, en el que la ADN polimerasa de la etapa 1) es ADN polimerasa de Phi29.
4. Método según la reivindicación 1 ó 2, en el que la endonucleasa especifica de metilación es la endonucleasa específica de CpG McrBC.
5. Método según la reivindicación 1 ó 2, en el que la endonucleasa de restricción sensible a metilación es un cóctel que comprende HpalI, Bsul51 (ClaI), Hin61, AciI (SsiI), TaiI, o cualquier combinación de las mismas.
6. Método según la reivindicación 1, en el que la etapa f) comprende además marcar las secuencias de nucleótidos de prueba no amplificadas de la etapa d) con el primer marcador, y marcar las secuencias de nucleótidos de control no amplificadas de la etapa d) con un segundo marcador.
7. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el fenotipo de interés comprende una enfermedad tal como cáncer, diabetes, enfermedad de Alzheimer o esquizofrenia, esclerosis múltiple, psoriasis, aterosclerosis, asma, autismo o artritis reumatoide.
8. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicha sonda es un fluoróforo químicamente reactivo.
9. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicho fluoróforo es Cy 3 o Cy 5.
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