AGENTES DE ETIQUETADO DOBLE BASADOS EN VINILSULFONA.

Agentes de etiquetado doble basados en vinilsulfona.

Agentes de etiquetado que comprenden un compuesto con dos moléculas etiqueta y un grupo vinilsulfona.

Además, se refiere a los compuestos, el procedimiento de obtención de los mismos y sus usos en el marcaje de biomoléculas, y más concretamente de proteínas

Tipo: Patente de Invención. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: P200800592.

Solicitante: UNIVERSIDAD DE GRANADA.

Nacionalidad solicitante: España.

Provincia: GRANADA.

Inventor/es: SANTOYO GONZALEZ,FRANCISCO, HERNANDEZ MATEO,FERNANDO, SALTO GONZALEZ,RAFAEL, MORALES SANFRUTOS,JULIA, LOPEZ JARAMILLO,FCO. JAVIER, GIRON GONZALEZ,DOLORES.

Fecha de Solicitud: 29 de Febrero de 2008.

Fecha de Publicación: .

Fecha de Concesión: 20 de Mayo de 2010.

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C07D249/04 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C07 QUIMICA ORGANICA.C07D COMPUESTOS HETEROCICLICOS (Compuestos macromoleculares C08). › C07D 249/00 Compuestos heterocíclicos que contienen ciclos de cinco miembros que tienen tres átomos de nitrógeno como únicos heteroátomos del ciclo. › 1,2,3-Triazoles; Triazoles 1,2,3 hidrogenados.
  • C07D495/04 C07D […] › C07D 495/00 Compuestos heterocíclicos que contienen en el sistema condensado al menos un heterociclo que tiene átomos de azufre como únicos heteroátomos del ciclo. › Sistemas orto-condensados.
  • C09B62/503 C […] › C09 COLORANTES; PINTURAS; PULIMENTOS; RESINAS NATURALES; ADHESIVOS; COMPOSICIONES NO PREVISTAS EN OTRO LUGAR; APLICACIONES DE LOS MATERIALES NO PREVISTAS EN OTRO LUGAR.C09B COLORANTES ORGANICOS O COMPUESTOS ESTRECHAMENTE RELACIONADOS PARA PRODUCIR COLORANTES; MORDIENTES; LACAS (procesos de fermentación o procesos que utilizan enzimas para la síntesis de un compuesto dado C12P). › C09B 62/00 Colorantes reactivos, es decir, colorantes que forman enlaces covalentes con los sustratos o que se polimerizan con ellos mismos. › siendo el grupo reactivo un grupo hidroxialquilsufonilo o un grupo mercaptoalquilsulfonilo, esterificado o no esterificado, un grupo aminoalquilsufonilo cuaternizado o no cuaternizado, un grupo heterilmercaptoalquilsulfonilo, un grupo vinilsulfonilo, un grupo vinilsulfonilo sustituido, o un grupo dióxido de tiofeno.
  • G01N33/531 SECCION G — FISICA.G01 METROLOGIA; ENSAYOS.G01N INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION DE SUS PROPIEDADES QUIMICAS O FISICAS (procedimientos de medida, de investigación o de análisis diferentes de los ensayos inmunológicos, en los que intervienen enzimas o microorganismos C12M, C12Q). › G01N 33/00 Investigación o análisis de materiales por métodos específicos no cubiertos por los grupos G01N 1/00 - G01N 31/00. › Producción de materiales de investigación o análisis inmunoquímicos.
  • G01N33/533 G01N 33/00 […] › con un marcador fluorescente.
  • G01N33/58D
  • G01N33/68A

Clasificación PCT:

  • C07D249/04 C07D 249/00 […] › 1,2,3-Triazoles; Triazoles 1,2,3 hidrogenados.
  • C07D495/04 C07D 495/00 […] › Sistemas orto-condensados.
  • C09B62/503 C09B 62/00 […] › siendo el grupo reactivo un grupo hidroxialquilsufonilo o un grupo mercaptoalquilsulfonilo, esterificado o no esterificado, un grupo aminoalquilsufonilo cuaternizado o no cuaternizado, un grupo heterilmercaptoalquilsulfonilo, un grupo vinilsulfonilo, un grupo vinilsulfonilo sustituido, o un grupo dióxido de tiofeno.
  • G01N33/531 G01N 33/00 […] › Producción de materiales de investigación o análisis inmunoquímicos.
  • G01N33/533 G01N 33/00 […] › con un marcador fluorescente.
  • G01N33/58 G01N 33/00 […] › en los que intervienen sustancias marcadas (G01N 33/53 tiene prioridad).
  • G01N33/68 G01N 33/00 […] › en los que intervienen proteínas, péptidos o aminoácidos.

Fragmento de la descripción:

Agentes de etiquetado doble basados en vinilsulfona.

La presente invención se refiere a un compuesto de fórmula general (I) que comprende dos moléculas etiquetas y un grupo vinilsulfona, cuya función es llevar a cabo la unión covalente a las moléculas susceptibles de etiquetado. La presente invención también se refiere a sus procedimientos de obtención y a sus usos. Más particularmente, se refiere al uso de estos compuestos conteniendo simultáneamente biotina y fluoróforos, para el etiquetado de biomoléculas y a sus aplicaciones biotecnológicas.


Estado de la técnica anterior

El etiquetado de biomoléculas es una herramienta básica en el campo de la genómica y la proteómica para la detección, purificación y estudio de interacciones entre biomoléculas.

De entre la gama de etiquetados de biomoléculas que son plausibles, destacan por su especial importancia los etiquetados con fluoróforos y con biotina debido a sus aplicaciones biotecnológicas y su impacto comercial.

El etiquetado fluorescente es un elemento clave para la detección y análisis de biomoléculas (Patton, W.F. Electrophoresis (2000), vol. 21, pp. 1123-1144) y es el motor de una industria de miles de millones de euros. Las ventajas del etiquetado fluorescente, frente a métodos convencionales como son el azul Coomassie, la plata, el oro coloidal o la radioactividad son las siguientes:

- Detección rápida y de sensibilidad elevada: cada etiqueta fluorescente puede originar del orden de 107-108 fotones por segundo.

- Versatilidad: Distintos etiquetados originan distintos "colores", siendo posible realizar un etiquetado "policromático" como el empleado, por ejemplo, en la secuenciación de ADN (Smith, L., et al., Nature (1986), vol. 321, pp. 674-679).

- Inercia: Tamaño y propiedades del fluoróforo raramente interfieren con la biomolécula marcada.

- Localización de la señal en el punto de etiquetado, a diferencia del etiquetado enzimático.

Sin embargo, su potencial va más allá de la detección pasiva dado que técnicas como la polarización de fluorescencia y FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer, también denominado Förster Resonance Energy Transfer) permiten evaluar cambios conformacionales, interacciones entre proteínas o entre proteína y ligando. La medida de la polarización proporciona información sobre orientaciones y movilidad que permite estudiar las interacciones receptor-ligando (Jameson, D.M., Seifried, S.E., Methods (1999), vol. 19, pp. 222-233). FRET es una interacción entre fluoróforos en la cual la excitación pasa de un fluoróforo excitado (donante) a otro que se excita (aceptor) sin la emisión de un fotón. Esta interacción se produce cuando la longitud de onda de emisión del donante es muy próxima a la de excitación del aceptor y es muy dependiente de la distancia entre donante y aceptor, por lo que se ha empleado como regla (Remedios, C.G., Moens, P.D., J. Struct. Biol. (1995), vol. 115, pp. 175-185) para analizar cambios conformacionales e interacción entre biomoléculas.

Actualmente existe una gran cantidad y variedad de fluoróforos. Entre los empleados para el etiquetado de biomoléculas se encuentran el dansilo, la fluoresceína y la rodamina B, cuyas características fundamentales y algunas de sus aplicaciones se resumen en la tabla adjunta:


Por otro lado, el etiquetado con biotina también tiene gran importancia biotecnológica (Wilchek, M.; Bayer, E. A., Anal. Biochem. (1988), vol. 171, pp. 1-32). La biotina es una molécula que actúa como grupo prostético de determinadas carboxilasas relacionadas con el metabolismo del dióxido de carbono. Sin embargo, su interés biotecnológico radica en la alta especificidad y afinidad que la avidina, estreptavidina y otras proteínas relacionadas presentan por esta biomolécula (constante de disociación del orden de 10-15 M-1), haciendo que la interacción tenga la fortaleza de un enlace covalente sin serlo. Así, la biotinilización transforma moléculas difícilmente detectables en sondas que pueden ser detectadas o capturadas con avidina/estreptavidina marcadas o inmovilizadas. Este principio es común para localizar antígenos en tejidos, células y para detectar biomoléculas en inmunoensayos y en pruebas de hibridación de ADN. Sin embargo, para determinadas aplicaciones, como por ejemplo la purificación mediante cromatografía de afinidad, se necesita que la interacción biotina-avidina sea reversible, para lo cual se puede modificar tanto la avidina (por nitrosación de las tirosinas del centro activo (Morag, E., et al., Biochem. J. (1996), vol. 316, pp. 193-199) como usar derivados de biotina (destiobiotina e iminobiotina). Existen biotinas marcadas fluorescentemente para cuantificar los sitios activos de la avidina (Gruber, H. J, et al., Biochim. Biophys. Acta (1998), vol. 1381, pp. 203-212) y biotina etiquetada con DNP (DNP-X-biocytin-X; US5180828A) (dinitrofenol), etiquetado versátil que además de actuar como cromóforo es reconocido por anticuerpos anti-DNP, permitiendo la correlación entre fluorescencia y estudios de microscopía electrónica. Existe también en el mercado peroxidasa de rábano picante (HRP) etiquetada con biotina.

Un aspecto fundamental de cara al uso de cualquier etiquetado es la unión a la biomolécula y la estabilidad de dicha unión. Desde un punto de vista químico existen cuatro grupos presentes en las biomoléculas susceptibles de actuar como dianas para el anclaje de los reactivos de etiquetado convenientemente derivatizados a través de la formación de un enlace covalente, como son las aminas, tioles, alcoholes y ácidos carboxílicos, que a continuación se detallan:

Aminas: Son la diana más común de los reactivos de modificación covalente y la principal en proteínas. En la mayoría de estas biomoléculas el extremo amino esta libre y además prácticamente todas tienen lisina, residuo en cuya cadena lateral hay un grupo varepsilon-amino fácilmente modificable dado que se localiza mayoritariamente en la superficie de las proteínas. Estos grupos reaccionan con reactivos acilantes y la reactividad es dependiente del reactivo acilante, del tipo de amina, basicidad y pH de reacción. Las aminas alifáticas, como la de la cadena lateral de la lisina, son moderadamente básicas y reaccionan con la mayoría de los reactivos acilantes a pH superior a 8.

Tres son las derivatizaciones de los reactivos de etiquetado que reaccionan con las aminas de las biomoléculas:

- Succinimidil ésteres. Reaccionan con aminas para originar amidas. Es la derivatización más frecuente dada la estabilidad del enlace amida que se genera. Reaccionan bien con aminas alifáticas y presentan baja reactividad con aminas aromáticas, alcoholes, fenoles (tirosina) e imidazoles (histidina). En presencia de tioles (cisteína) pueden formar tiosteres pero en proteínas el grupo acilo puede ser transferido a una amina vecina. Uno de los principales inconvenientes de los succinimidil ésteres es su solubilidad, que en algunos casos puede ser muy baja. Por ello, en el mercado existen derivados de ácidos carboxílicos que pueden convertirse en sulfosuccinimidil ésteres (Staros, J.V., et al., Anal. Biochem. (1986), vol. 156, pp. 220-222) o STP ésteres (Gee, K.R., et al., Tetrahedron Lett. (1999), vol. 40, pp. 1471-1474), que son más polares, y por ello más solubles en agua, aunque también menos reactivos con aminas poco expuestas.

- Isotiocianatos. Reaccionan con aminas para formar tioureas, las cuales son razonablemente estables en la mayoría de los casos.

- Cloruros de ácido sulfónico. Reaccionan con aminas y producen sulfonamidas. Son muy reactivos e inestables en medios acuosos, especialmente al pH alcalino necesario para que reaccionen con las aminas alifáticas, por lo que se trabaja a baja temperatura. Una vez conjugados el enlace es extremadamente estable y resistente. También reaccionan con fenoles (tirosina), alcoholes alifáticos (polisacáridos), tioles (cisteína), e imidazoles (histidina), aunque los conjugados con tioles e imidazoles son inestables y los conjugados con alcoholes alifáticos pueden sufrir desplazamientos nucleofílicos.

- Otras funcionalizaciones pueden ser: aldehídos y agentes arilantes. Aldehídos que reaccionan con las aminas...

 


Reivindicaciones:

1. Compuesto de fórmula general (I):


donde:

Y es el grupo -SO2R- ó no existe; donde

R es un radical, sustituido o no sustituido, seleccionado del grupo que comprende un alquilo (C1-C10), un dialquilarilo ((C1-C10)Ar(C1-C10)) ó el grupo (CH2CH2O)nCH2CH2; donde n toma valores de 2 a 20;

Z es un radical, sustituido o no sustituido, seleccionado del grupo que comprende un alquilo (C1-C10), un dialquilarilo ((C1-C10)Ar(C1-C10)) ó un grupo (CH2CH2O)nCH2CH2; donde n toma valores de 2 a 20;

m toma valores de 1 a 20; y

representan, independientemente, una molécula etiqueta.

2. Compuesto según la reivindicación 1, donde las moléculas etiqueta se seleccionan de entre biotina, fluoróforo o cualquiera de sus derivados.

3. Compuesto según la reivindicación 2, donde el fluoróforo se selecciona de entre dansilo, fluoresceína, rodamina o cualquiera de sus derivados.

4. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde Z es un alquilo (C1-C5).

5. Compuesto según la reivindicación 4, donde Z es un grupo etilo.

6. Compuesto según la reivindicación 4, donde Z es un grupo metilo.

7. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, donde m es 1.

8. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde Y es el grupo -SO2R.

9. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 donde R es el grupo (CH2CH2O)nCH2CH2, n está definido en la reivindicación 1.

10. Compuesto según la reivindicación 9, donde n es 2.

11. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde Y no existe.

12. Compuesto según la reivindicación 1, de fórmula:


13. Compuesto según la reivindicación 1, de fórmula:


14. Compuesto según la reivindicación 1, de fórmula:


15. Compuesto según la reivindicación 1, de fórmula:


16. Método de obtención de los compuestos de fórmula general (I) cuando Y es el grupo -SO2R que comprende la reacción del compuesto de fórmula general (II)


donde R y m están definidos en la reivindicación 1

con una molécula etiqueta o cualquiera de sus derivados, que contienen un grupo ácido ó sulfónilo, antes o después de reaccionar con otra molécula etiqueta o cualquiera de sus derivados distinta a la anterior que contiene un grupo azido.

17. Método según la reivindicación 16, donde los derivados de las moléculas etiqueta que contienen un grupo ácido o sulfonilo son cloruros de ácido o cloruros de sulfonilo.

18. Método según la reivindicación 16, donde R es el grupo (CH2CH2O)nCH2CH2, n está definido en la reivindicación 1.

19. Método según la reivindicación 18, donde n es 2.

20. Método según cualquiera de las reivindicaciones 16 a 19, donde m es 1.

21. Método de obtención de los compuestos de fórmula general (I), cuando

Y no existe, que comprende:

a. reacción del compuesto de fórmula general (III) con una molécula etiqueta o sus derivados, que contiene un grupo sulfonilo:

donde m está definido anteriormente; y
b. reacción del compuesto obtenido en el paso (a) con otra molécula etiqueta o sus derivados, distinta de la anterior y que contiene un grupo azido.

22. Método según la reivindicación 21, donde los derivados de las moléculas etiqueta que contienen un grupo sulfonilo son cloruros de sulfonilo.

23. Método según la reivindicación 21, donde m es 1.

24. Uso de un compuesto de fórmula general (I) según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 como agente de etiquetado.

25. Agente de etiquetado que comprende un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15.

26. Uso de un agente de etiquetado según la reivindicación 25 para el marcaje de biomoléculas.

27. Uso de un agente según la reivindicación 26, donde las biomoléculas son proteínas.


 

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