ACETOLACTATO SINTASA MUTANTE Y PROCEDIMIENTO PARA PRODUCIR L-AMINOACIDOS DE CADENA RAMIFICADA.

Subunidad pequeña mutante de acetolactato sintasa bacteriana (AHAS I) que comprende la subunidad pequeña de acetolactato sintasa de tipo salvaje de Escherichia coli que comprende una mutación seleccionada de entre el grupo que consiste en:

A) sustituir el L-aminoácido en la posición 17 y/o 30 en la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº 2 con otro L-aminoácido,

B) sustituir la parte N-terminal corriente abajo desde el L-aminoácido en la posición 44 en la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº 2 con diversos L-aminoácidos, y

C) sus combinaciones, y en la que dicha subunidad pequeña mutante de acetolactato sintasa se desensibiliza a la inhibición por retroalimentación por valina

Acetolactato sintasa mutante y procedimiento para producir L-aminoácidos de cadena ramificada.

Antecedentes de la invención

La presente invención se refiere a biotecnología, y particularmente a un procedimiento para preparar L-aminoácidos de cadena ramificada. Más específicamente, la presente invención da a conocer la utilización de una nueva enzima resistente a L-valina involucrada en la biosíntesis de L-aminoácidos de cadena ramificada. Más específicamente, la presente invención se refiere a acetolactato sintasa mutante (AHAS I) resistente a L-valina purificada a partir de E. coli, una bacteria de la familia Enterobacteriaceae que contiene dicha enzima sintasa, y a un procedimiento para preparar L-aminoácidos de cadena ramificada por fermentación utilizando las cepas de dicha bacteria.

Tradicionalmente, los L-aminoácidos se han producido industrialmente por fermentación utilizando cepas de microorganismos obtenidas de fuentes naturales, o mutantes de las mismas que se han modificado específicamente con el fin de aumentar la productividad de los L-aminoácidos.

Anteriormente se han descrito muchas técnicas para aumentar específicamente la productividad de L-aminoácidos, tal como, por ejemplo, la transformación de microorganismos con ADN recombinante (véase, por ejemplo, la patente US nº 4.278.765). Dichas técnicas se basan en incrementar las actividades de las enzimas involucradas en la biosíntesis de aminoácidos y/o desensibilizar las enzimas diana a la inhibición por retroalimentación por el L-aminoácido producido (véase, por ejemplo, la solicitud de patente japonesa abierta a inspección 56-18596 (1981), WO 95/16042 o las patentes US nº 5.661.012 y nº 6.040.160).

La biosíntesis de isoleucina, leucina y valina tiene lugar a través de una ruta ramificada en la que tres etapas son comunes a cada producto final. La reacción AHAS representa la primera etapa biosintética común a los tres productos. Dicha reacción está catalizada por isoenzimas que son la diana de la inhibición del producto final por valina. Dicha regulación tiene un papel central en el control fisiológico de la ruta en la bacteria. La reacción incluye la condensación del acetaldehído activo (derivado de piruvato) con a-cetobutirato o piruvato con el fin de obtener a-aceto-a-hidroxibutirato (un precursor de isoleucina) o a-acetolactato (un precursor de leucina y valina), respectivamente.

Se ha documentado que la valina y su precursor ceto-ácido, el ácido a-cetoisovalérico, inhiben el crecimiento de E. coli K12, y que la isoleucina contrarresta dicha inhibición (Tatum, E.L., Fed. Proc. 8:511 (1946)). Actualmente, se acepta de forma generalizada que la inhibición de valina resulta principalmente de bloquear la síntesis de a-aceto-a-hidroxibutirato. Un análisis de la E. coli K12 ha puesto de manifiesto que esta cepa contiene los genes estructurales para las tres actividades AHAS, que se designan como isoenzimas AHAS I, AHAS II y AHAS III. AHAS I y AHAS III son inhibidas por valina, mientras que AHAS II es resistente a la misma; sin embargo, AHAS II no está expresada normalmente en las células de E. coli K12 (Guardiola, J. y otros, Mol. Gen. Genet. 156: 17-25 (1977)). Todas las isoenzimas AHAS de enterobacterias están compuestas por una subunidad grande y una subunidad pequeña en una estructura a₂ß₂, desempeñando las subunidades grandes una función catalítica y desempeñando las subunidades pequeñas una función reguladora. Las subunidades pequeñas son absolutamente necesarias para la sensibilidad de la actividad enzimática al inhibidor por retroalimentación por valina. Un estudio de las propiedades individuales de las subunidades de AHAS I y AHAS III (Weinstock O. y otros, J. Bacteriol. 174:5560-5566 (1992)) mostró que las subunidades pequeñas inducen específicamente una conformación catalíticamente competidora de la enzima entera y estabilizan el estado de transición.

Sobre la base de un modelo de la región enlazadora de valina de la subunidad pequeña reguladora de la AHAS III de la E. coli, se llevaron a cabo truncamientos del extremo carboxilo de la subunidad pequeña. Dichos truncamientos inducen la ausencia de sensibilidad a la valina en las enzimas truncadas de AHAS III (Mendel S. y otros, J Mol Biol.10;325(2):275-84 (2003)).

Sin embargo, en la actualidad no existen trabajos que describan una acetolactato sintasa bacteriana mutante (AHAS I) que sea resistente a la retroalimentación por valina y la utilización de una acetolactato sintasa mutante de este tipo para mejorar la producción de L-aminoácidos de cadena ramificada en las correspondientes cepas productoras de L-aminoácidos.

Sumario de la invención

La presente invención da a conocer una nueva acetolactato sintasa bacteriana mutante con el objetivo de desarrollar cepas productoras de L-aminoácidos de cadena ramificada con una productividad aumentada de L-aminoácidos de cadena ramificada, y da a conocer un procedimiento para producir L-aminoácidos de cadena ramificada utilizando dichas cepas.

La presente invención se alcanzó construyendo una nueva acetolactato sintasa mutante a partir de E. coli. Esta acetolactato sintasa mutante procedente de E. coli presenta una mutación en la unidad reguladora IlvN, específicamente Asn-17, Ala-30 y/o Ile-44. Se demostró que esta acetolactato sintasa mutante aumenta la producción de L-aminoácidos de cadena ramificada cuando el ADN que codifica la enzima mutante se introduce en la cepa productora de L-aminoácido de cadena ramificada.

Un aspecto de la presente invención consiste en proporcionar una subunidad pequeña mutante de acetolactato sintasa bacteriana (AHAS I) que comprende la subunidad pequeña de acetolactato sintasa de tipo salvaje de Escherichia coli que comprende una mutación seleccionada entre el grupo que consiste en: sustituir el L-aminoácido de la posición 17 y/o 30 de la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº 2 con otro L-aminoácido, sustituir la parte N-terminal corriente abajo con respecto al L-aminoácido de la posición 44 de la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº 2 con diversos L-aminoácidos, y combinaciones de los mismos, estando dicha subunidad pequeña mutante de acetolactato sintasa desensibilizada a la inhibición por retroalimentación por valina.

Otro aspecto de la presente invención consiste en proporcionar la subunidad pequeña mutante de acetolactato sintasa bacteriana (AHAS I) descrita anteriormente, estando sustituido dicho L-aminoácido de la posición 17 con un residuo de lisina.

Otro aspecto de la presente invención consiste en proporcionar la subunidad pequeña mutante de acetolactato sintasa bacteriana (AHAS I) descrita anteriormente, estando sustituido dicho L-aminoácido de la posición 30 con un residuo de prolina.

Otro aspecto de la presente invención consiste en proporcionar la subunidad pequeña mutante de acetolactato sintasa bacteriana (AHAS I) descrita anteriormente, estando sustituida dicha parte N-terminal corriente abajo con respecto al L-aminoácido de la posición 44 con arginina y fenilalanina.

Otro aspecto de la presente invención consiste en proporcionar la subunidad pequeña mutante de acetolactato sintasa bacteriana (AHAS I) descrita anteriormente, en la que dicho L-aminoácido de la posición 17 sustituido con un residuo de lisina es asparagina.

Otro aspecto de la presente invención consiste en proporcionar la subunidad pequeña mutante de acetolactato sintasa bacteriana (AHAS I) descrita anteriormente, en la que dicho L-aminoácido de la posición 30 sustituido con un residuo de prolina es alanina.

otro aspecto de la presente invención consiste en proporcionar la subunidad pequeña mutante de acetolactato sintasa bacteriana (AHAS I) descrita anteriormente, en la que dicho L-aminoácido de la posición 44 sustituido con arginina y fenilalanina es isoleucina.

Otro aspecto de la presente invención consiste en proporcionar una acetolactato sintasa bacteriana mutante que comprende la subunidad pequeña descrita anteriormente.

Otro aspecto de la presente invención consiste en proporcionar la acetolactato sintasa mutante descrita anteriormente, en la que dicha acetolactato sintasa mutante comprende la subunidad grande de Escherichia coli.

Otro aspecto de la presente invención consiste en proporcionar la acetolactato sintasa bacteriana mutante descrita anteriormente,...

1. Subunidad pequeña mutante de acetolactato sintasa bacteriana (AHAS I) que comprende la subunidad pequeña de acetolactato sintasa de tipo salvaje de Escherichia coli que comprende una mutación seleccionada de entre el grupo que consiste en:

A)        sustituir el L-aminoácido en la posición 17 y/o 30 en la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº 2 con otro L-aminoácido,

B)        sustituir la parte N-terminal corriente abajo desde el L-aminoácido en la posición 44 en la secuencia de aminoácidos de SEC ID nº 2 con diversos L-aminoácidos, y

C)        sus combinaciones,

y en la que dicha subunidad pequeña mutante de acetolactato sintasa se desensibiliza a la inhibición por retroalimentación por valina.

2. Subunidad pequeña mutante de acetolactato sintasa bacteriana según la reivindicación 1, en la que dicho L-aminoácido en la posición 17 se sustituye por un residuo de lisina.

3. Subunidad pequeña mutante de acetolactato sintasa bacteriana según la reivindicación 1, en la que dicho L-aminoácido en la posición 30 se sustituye por un residuo de prolina.

4. Subunidad pequeña mutante de acetolactato sintasa bacteriana según la reivindicación 1, en la que dicha parte N-terminal corriente abajo desde el L-aminoácido en la posición 44 se sustituye con arginina y fenilalanina.

5. Subunidad pequeña mutante de acetolactato sintasa bacteriana según la reivindicación 2, en la que dicho L-aminoácido en la posición 17 que se sustituye por un residuo de lisina es la asparagina.

6. Subunidad pequeña mutante de acetolactato sintasa bacteriana según la reivindicación 3, en la que dicho L-aminoácido en la posición 30 que se sustituye por un residuo de prolina es la alanina.

7. Subunidad pequeña mutante de acetolactato sintasa bacteriana según la reivindicación 4, en la que dicho L-aminoácido en la posición 44 es la isoleucina.

8. Acetolactato sintasa mutante que comprende la subunidad pequeña según la reivindicación 1.

9. Acetolactato sintasa mutante según la reivindicación 8, en la que dicha acetolactato sintasa mutante comprende la subunidad grande de Escherichia coli.

10. acetolactato sintasa mutante según la reivindicación 8, en la que la subunidad pequeña incluye eliminaciones, sustituciones, inserciones, o adiciones de uno a 15 aminoácidos en una o más posiciones distintas de la posición 17, 30 y/o 44, y en la que dicha acetolactato sintasa mutante mantiene la actividad de acetolactato sintasa y está desensibilizada a la inhibición por retroalimentación por valina.

11. ADN que codifica la subunidad pequeña mutante de la acetolactato sintasa según la reivindicación 1.

12. Bacteria de la familia Enterobacteriaceae, que contiene el ADN según la reivindicación 11 y presenta la capacidad de producir L-aminoácidos de cadena ramificada.

13. Bacteria según la reivindicación 12, en la que dichos L-aminoácidos de cadena ramificada se seleccionan de entre el grupo que consiste en L-leucina, L-isoleucina y L-valina.

14. Bacteria según la reivindicación 13, en la que se aumenta la actividad de la acetolactato sintasa mutante.

15. Bacteria según la reivindicación 14, en la que la bacteria pertenece al género Escherichia.

16. Bacteria según la reivindicación 15, en la que se aumenta la actividad de la acetolactato sintasa mutante incrementando la expresión del gen de la acetolactato sintasa mutante.

17. Bacteria según la reivindicación 16, en la que se incrementa la actividad de la acetolactato sintasa mutante mediante un procedimiento seleccionado de entre el grupo que consiste en:

a)        incrementar el número de copias del gen de la acetolactato sintasa mutante,

b)        modificar una secuencia de control de expresión del gen de manera que la expresión del gen aumenta, y

c)        sus combinaciones.

18. Bacteria según la reivindicación 17, en la que el número de copias se incrementa mediante la integración de múltiples copias del gen de la acetolactato sintasa mutante en el cromosoma de la bacteria.

19. procedimiento para preparar un L-aminoácido de cadena ramificada que comprende cultivar la bacteria según la reivindicación 12 en un medio de cultivo y recoger los L-aminoácidos de cadena ramificada del medio de cultivo.

20. Procedimiento según la reivindicación 19, en el que la bacteria presenta una expresión aumentada de genes implicados en la biosíntesis de L-aminoácido de cadena ramificada.

21. Procedimiento según la reivindicación 20, en el que dicho L-aminoácido de cadena ramificada se selecciona de entre el grupo que consiste en L-leucina, L-isoleucina y L-valina.