TRITERPENO HIDROXILASA.

Un método para producir un triterpeno de tipo oleanano en el cual la posición 24 está hidroxilada

, que comprende: el cultivo de un transformante que contiene un vector de expresión con un polinucleótido que hibrida con una cadena complementaria del polinucleótido representado por la SEC ID Nº: 8 bajo condiciones rigurosas y también codifica un polipéptido que tiene actividad hidroxilante de la posición 24 de un triterpeno de tipo oleanano, con el fin de producir un polipéptido de SEC ID Nº: 9; y el permitir que el transformante actúe sobre un triterpeno de tipo oleanano, donde el transformante es un microorganismo

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/JP2005/003205.

Solicitante: MEIJI SEIKA KAISHA, LTD..

Nacionalidad solicitante: Japón.

Dirección: 4-16, KYOBASHI 2-CHOME, CHUO-KU TOKYO 104-8002 JAPON.

Inventor/es: HAYASHI,Hiroaki,Gifu Pharmaceutical University, INOUE,Kenichiro,Gifu Pharmaceutical University, HOSHINO,Masateru,Graduate School of Pharm. Sc, SHIBUYA Masaaki,Graduate School of Pharm. Sc, EBIZUKA Yutaka,Graduate School of Pharm. Sc.

Fecha de Publicación: .

Fecha Solicitud PCT: 25 de Febrero de 2005.

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Enzimas, p. ej. ligasas (6.; Proenzimas; Composiciones... > C12N9/02 (Oxidorreductasas (1.), p. ej. luciferasa)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN... > Preparación de esteroides > C12P33/06 (Hidroxilación)
  • C12N9/02L99

Clasificación PCT:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > C12N9/00 (Enzimas, p. ej. ligasas (6.; Proenzimas; Composiciones que las contienen (preparaciones para la limpieza de los dientes que contienen enzimas A61K 8/66, A61Q 11/00; preparaciones de uso médico que contienen enzimas A61K 38/43; composiciones detergentes que contienen enzimas C11D ); Procesos para preparar, activar, inhibir, separar o purificar enzimas)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/53 (Oxidorreductasas (1))
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Microorganismos, p.ej. protozoos; Composiciones que... > C12N1/19 (modificados por la introducción de material genético extraño)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Enzimas, p. ej. ligasas (6.; Proenzimas; Composiciones... > C12N9/02 (Oxidorreductasas (1.), p. ej. luciferasa)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN... > Preparación de esteroides > C12P33/06 (Hidroxilación)

Clasificación antigua:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > C12N9/00 (Enzimas, p. ej. ligasas (6.; Proenzimas; Composiciones que las contienen (preparaciones para la limpieza de los dientes que contienen enzimas A61K 8/66, A61Q 11/00; preparaciones de uso médico que contienen enzimas A61K 38/43; composiciones detergentes que contienen enzimas C11D ); Procesos para preparar, activar, inhibir, separar o purificar enzimas)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/53 (Oxidorreductasas (1))
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Microorganismos, p.ej. protozoos; Composiciones que... > C12N1/19 (modificados por la introducción de material genético extraño)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Enzimas, p. ej. ligasas (6.; Proenzimas; Composiciones... > C12N9/02 (Oxidorreductasas (1.), p. ej. luciferasa)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > SISTEMA DE INDEXACION ASOCIADO A LAS SUBCLASES C12C... > Microorganismos > C12R1/645 (Hongos)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN... > Preparación de esteroides > C12P33/06 (Hidroxilación)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > SISTEMA DE INDEXACION ASOCIADO A LAS SUBCLASES C12C... > Microorganismos > C12R1/91 (Líneas celulares)

Países PCT: Austria, Bélgica, Suiza, Alemania, Dinamarca, España, Francia, Reino Unido, Grecia, Italia, Liechtensein, Luxemburgo, Países Bajos, Suecia, Mónaco, Portugal, Irlanda, Eslovenia, Finlandia, Rumania, Chipre, Lituania.

PDF original: ES-2357241_T3.pdf

 

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Ilustración 1 de TRITERPENO HIDROXILASA.
Ilustración 2 de TRITERPENO HIDROXILASA.
Ilustración 3 de TRITERPENO HIDROXILASA.
Ilustración 4 de TRITERPENO HIDROXILASA.
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TRITERPENO HIDROXILASA.

Fragmento de la descripción:

Campo Técnico

Esta invención se refiere a una célula transformada mediante una técnica de ingeniería genética con el gen de un enzima que está implicado en la biosíntesis del sojasapogenol B derivado de plantas, y a un método para producir sojasapogenol B haciendo uso de la célula. 5

Antecedentes de la Invención

El sojasapogenol B (12-oleaneno-3,22,24-triol) es un triterpeno con un esqueleto oleanano, que ha sido aislado de la semilla de soja y cuya estructura ha sido determinada (Chem. Pharm. Bull., 24, pp. 121-129, 1976; Chem. Pharm. Bull., 30, pp. 2294-2297, 1982) (Referencias no Patentes 1 y 2) y su glucósido sojasaponina está ampliamente distribuido en las plantas leguminosas. 10

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En lo que se refiere al sojasapogenol B, se han descrito hasta ahora su actividad anti-complemento y su acción inhibidora de la aglutinación plaquetaria (JP-A-61-37749) (Referencia de Patente 1), su actividad antitumoral (JP-A-10-234396) (Referencia de Patente 2) y su actividad hepatoprotectora (Bioorg. Med. Chem. Lett., 7, 85-88, 1997) (Referencia no Patente 3), etcétera, y se espera su utilidad como una preparación farmacéutica o como un material de la misma. 15

En lo que respecta al método de producción de sojasapogenol B, se conoce un método en el cual cadenas de azúcar de la saponina contenida en las semillas de soja son hidrolizadas y posteriormente el sojasapogenol B es purificado, pero como la proporción de saponina contenida en las semillas de soja es del 0,2% aproximadamente, la cual es muy pequeña (Yakugaku Zasshi, (Journal of Pharmaceutical Sciences), 104, 162-168, 1984) (Referencia no Patente 4), existe la demanda de un método de producción más eficaz. 20

Se considera que la β-amirina, como precursor biosintético del sojasapogenol B, es biosintetizada mediante el cierre del anillo del 2,3-oxidoescualeno que se forma a través de la ruta del mevalonato, y el sojasapogenol B es biosintetizado posteriormente a través de dos etapas de reacciones de hidroxilación.

El soforadiol (12-oleaneno-3,22-diol), próximo estructuralmente al sojasapogenol B, es una sus-tancia sobre la que se ha informado que es un componente de la Kaika (Sophora japonica) (Yakugaku Zasshi, 78, 25 1090-1094, 1958) (Referencia no Patente 5) y es posible producir sojasapogenol B mediante la hidroxilación de la posición 24 del soforadiol.

En realidad, se ha descrito un método para producir sojasapogenol B por hidroxilación de la posición 24 del soforadiol utilizando una hidroxilasa derivada de una célula cultivada de Glycyrrhiza glabra (WO 02/086142) (Referencia de Patente 3). 30

Referencia de Patente 1: JP-A-61-37749

Referencia de Patente 2: JP-A-10-234396

Referencia de Patente 3: Publicación Internacional WO 02/086142

Referencia no Patente 1: Chem. Pharm. Bull., 24, pp. 121-129, 1976

Referencia no Patente 2: Chem. Pharm. Bull., 30, pp. 2294-2297, 1982 35

Referencia no Patente 3: Bioorg. Med. Chem. Lett., 7, 85-88, 1997

Referencia no Patente 4: Yakugaku Zasshi, (Journal of Pharmaceutical Sciences), 104, 162-168, 1984

Referencia no Patente 5: Yakugaku Zasshi, 78, 1090-1094, 1958.

Descripción de la Invención

Problemas que la Invención ha de Resolver 40

La β-amirina es un precursor biosintético del sojasapogenol B. La misma es biosintetizada por el cierre del anillo del 2,3-oxidoescualeno que se forma a través de la ruta del mevalonato, y el sojasapogenol B es biosintetizado posteriormente a través de dos etapas de reacciones de hidroxilación. Sin embargo, el gen de la hidroxilasa implicado en esta reacción no ha sido revelado. Por tanto, era imposible aplicar una técnica de ingeniería genética sobre la hidroxilasa. 45

Steele, C.L. y col. (“Molecular Characterization of the Enzyme Catalyzing the Aryl Migration Reaction of Isoflavoid Biosynthesis in Soybean”; Archives of Biochemistry and Biophysics, Vol. 367, Nº 1, 1999, páginas 146-150) describen el gen del citocromo P450 clonado en un vector baculovírico y la expresión de P450 en células de insecto y en células vegetales. La secuencia de nucleótidos y de proteínas de CYP93E1 fue enviada a la base de datos EMBL/GenBank/DDBJ (Nº de Acceso del GenBank AF135485). 50

US 2004/031072 A1 describe construcciones de ADN recombinante que contienen polinucleótidos (de acuerdo con las secuencias SEC ID Nº: 1 a SEC ID Nº: 142.842) útiles para la mejora de plantas. Las Secuencias 100510 y 243352 descritas en US 2004/031072 A1, corresponden al gen y al polipéptido del citocromo P450, respectivamente. El material genético exógeno puede ser transferido a una célula vegetal mediante la utilización de un vector de ADN que puede ser diseñado para que se replique en E. coli y A. tumefaciens. 5

WO 02 086142 A1 describe la producción de sojasapogenol B mediante el tratamiento de soforadiol con una hidroxilasa originaria de una planta para hidroxilar el compuesto en su posición 24.

Hayashi, H. y col. (“Glycyrrhetinic acid 24-hidroxylase activity in microsomes of cultured licorice cells”; Photochemistry, Vol. 34, Nº 5, 1993, páginas 1303-1307) informan de la existencia de una monooxigenasa dependiente del citocromo P450 que cataliza la hidroxilación del grupo metilo en C-24 del ácido glicirretínico. 10

Medios para Resolver los Problemas

Sobre la base de la suposición de que el gen de un enzima de tipo citocromo P450 implicado en la biosíntesis del sojasapogenol B a partir de β-amirina está contenido en un clon de EST (Marcador de Secuencia Expresada) de la soja productor de sojasaponina con una elevada tasa de producción o en un clon cuya función no está identificada, los presentes inventores han llevado a cabo el análisis de las funciones de estos clones 15 de soja utilizando una cepa de levadura mutante deficiente en lanosterol. Entre los clones analizados, la actividad hidroxilante de la posición 24 de un triterpeno de tipo oleanano, que no puede ser detectada originalmente, fue de-tectada en una cepa de levadura en la cual se transcribió y tradujo el polinucleótido representado por la SEC ID Nº: 8. La secuencia polinucleotídica del enzima detectado con actividad hidroxilante es la SEC ID Nº: 8 y la secuencia polipeptídica deducida es la SEC ID Nº: 9. Se conoce una secuencia que tiene similitud con la SEC ID Nº: 8, el gen 20 CYP93E1 del citocromo P450 (Número de Acceso del GenBank AF135485, SEC ID Nº: 10, cuya secuencia poli-peptídica deducida es la SEC ID Nº: 11). El polinucleótido representado por la SEC ID Nº: 8 y el polinucleótido representado por la SEC ID Nº: 10 son diferentes entre sí en términos de 3 posiciones, la posición 121, la posición 171 y la posición 1081 (de aquí en adelante, la secuencia representada por la SEC ID Nº: 8 es denominada también en algunos casos gen CYP93E1 del citocromo P450). Además, el polipéptido representado por la SEC ID Nº: 9 y el 25 polipéptido representado por la SEC ID Nº: 11 son diferentes entre sí en términos de las posiciones de aminoácidos 41 y 61. Los presentes inventores han revelado que el polinucleótido representado por la SEC ID Nº: 8 codifica una proteína enzimática que lleva a cabo la hidroxilación de la posición 24 de un triterpeno de tipo oleanano. Sobre... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un método para producir un triterpeno de tipo oleanano en el cual la posición 24 está hidroxilada, que comprende:

el cultivo de un transformante que contiene un vector de expresión con un polinucleótido que hibrida con una cadena complementaria del polinucleótido representado por la SEC ID Nº: 8 bajo condiciones rigurosas y también codifica un polipéptido que tiene actividad hidroxilante de la posición 24 de un triterpeno de tipo 5 oleanano, con el fin de producir un polipéptido de SEC ID Nº: 9; y

el permitir que el transformante actúe sobre un triterpeno de tipo oleanano,

donde el transformante es un microorganismo.

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el polinucleótido es el polinucleó-tido representado por la SEC ID Nº: 8. 10

3. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el transformante es una levadura.