Un vector de expresión, comprendiendo dicho vector un casete de expresión que comprende desde 5' a 3' los siguientes elementos:

una secuencia promotora de citomegalovirus (CMV), una secuencia potenciadora de CMV, una secuencia de intrón A del gen temprano inmediato principal de CMV, una secuencia de ácido nucleico heterólogo y un sitio de poliadenilación, en el que el promotor está unido de forma operatible a la secuencia de ácido nucleico heterólogo, y en el que el casete se expresión comprende los nucleótidos 1-1653 de la secuencia expuesta en SEC ID Nº: 3

Antecedentes de la invención

A pesar de la enorme inversión financiera y de recursos humanos, el cáncer continúa siendo una de las principales causas de muerte. Por ejemplo, los cánceres de mama, pulmón, colon, próstata, vejiga, y riñón, así como múltiples enfermedades malignas hematológicas (p. ej., leucemia mieloide aguda (LMA) en adultos y pediátrica leucemia mieloide crónica (LMC), leucemia linfocítica aguda (LLA), leucemia linfocítica crónica (LLC) y leucemia secundaria) producen más seis millones de muertes anuales (véase, p. ej., Wang y col., Oncogene 19:1519-1528 (2000)).

Los enfoques habituales para curar el cáncer se han centrado alrededor de una combinación de cirugía, radiación y quimioterapia. Estos enfoques han tenido como resultado algunos éxitos espectaculares en determinadas enfermedades malignas. Sin embargo, el cáncer es a menudo incurable, cuando se diagnostica más allá de una fase determinada. Son necesarios enfoques terapéuticos alternativos.

Una característica frecuente de las enfermedades malignas es el crecimiento celular incontrolado. Las células cancerosas parecen sufrir un proceso de transformación desde el fenotipo normal a un fenotipo maligno capaz de crecer de forma autónoma. La amplificación y la sobreexpresión de genes de células somáticas (es decir, antígenos) se consideran acontecimientos primarios habituales que tienen como resultado la transformación de células normales en células malignas. Las características fenotípicas malignas codificadas por los genes oncogénicos se transmiten durante la división celular a la progenie de las células transformadas.

Recientemente se han identificado varios antígenos que se sobreexpresan en el cáncer (véase, p. ej., Loeb y col., Cancer Res. 61:921-92 (2001); Xu y col., Cancer Res. 51:1563-1568 (2001); Gaiger y col., Proc. Amer. Assoc. Cancer Res. 946 (2002); Wang y col., Oncogene 19:1519-1528 (2000); Xu y col., Intl. J. Mol. Med. 8:S68 (2001); Wang y col., Oncogene 20:7699-709 (2001); Jager y col., Cancer Res. 61:2055-2061 (2001); Mhashilkar y col., Mol. Med. 7:271-282 (2001); Jiang y col., Amer. J. Surg. Path. 25:1397-1404 (2001); Fanger y col., Proc. Amer. Assoc. Cancer Res. 574 (2000); Calhoun y col., Proc. Amer. Assoc. Cancer Res. 437-438 (2000); Meagher y col., Proc. Amer. Assoc. Cancer Res. 173 (2000); Xu y col., Cancer Res. 60:1677-1682 (2000); Wang y col., Oncogene 19:1519-1528 (2000); Villaret y col., Laryngoscope 110: de 68.374-381 (2000); Bangur y col., Proc. Amer. Assoc. Cancer Res. 680 (2000); Henderson y col., Immunol. Invest. 29:87-91 (2000); Pyle y col., Proc. Amer. Assoc. Cancer Res. 679 (2000); Mayo y col., EMBO 18 (14): 3990-4003 (1999)). Algunos de estos antígenos han sido identificados como oncogenes, es decir, genes operativos en células malignas y responsables de la transformación o asociados con ella, e incluyen, por ejemplo, el gen supresor de tumores de Wilms (WT1) y B726P, ambos sobreexpresados en tumores de mama; L523S, sobreexpresado en el carcinoma de pulmón de células escamosas, y P501 S sobreexpresado en tumores de próstata (véase, por ejemplo., Xu y col., Cancer Res. 61:1563-68, 2001)). Estos antígenos pueden usarse convenientemente para diagnóstico y tratamiento de cánceres. Por ejemplo, estos antígenos puede usarse convenientemente para generar respuestas inmunitarias específicas contra el cáncer. En particular, los polipéptidos de WT1 se han usado en vacunas basadas en proteínas (véase, por ejemplo., Gaiger y col., Proc. Amer. Assoc. Cancer Res. 42:698 (2001)).

La inmunización con ácido nucleico (es decir, inmunización genética) es una tecnología prometedora que puede avanzar en la eficacia y seguridad de las vacunas (véase, por ejemplo, Cui y col., J. Biotechnol. 102(2): 105-115 (2003); Robinson y Torres, Semin. Immunol. 9:271 (1997); Robinson y col., Int. J. Mol. Med. 4:549 (1999); y Hartikka y col., Hum. Gene Ther. 7:1205-1217 (1996)). Hay varias ventajas bien caracterizadas de las vacunas de ácido nucleico en comparación con las vacunas basadas en proteínas o virus vivos atenuados. Un rasgo característico de la vacunación con ADN es la inducción de la actividad de linfocitos T citotóxicos (CTL) que es superior a la vacunación con proteínas. La inmunidad celular puede potenciarse debido a que la proteína codificada por el ácido nucleico es procesada y presentada en una forma que es análoga al procesamiento de antígenos virales (véase, por ejemplo, Corr y col., J. Exp. Med. 184:1555 (de 1996)). Además, los vectores basados en plásmidos son más fáciles de producir que las vacunas basadas en proteínas u organismos vivos enteros, y se consideran más seguras de usar. Finalmente, se espera que sea más fácil incorporar antígenos nuevos o alterados en vacunas de ADN.

La inmunidad protectora después la vacunación con ADN se ha demostrado en varios modelos de ratón (véase, p. ej., Wang y col., Vaccine; 21 (15): 1672-80 (2003); Manickan y col., J. Immunol. 155:259 (1995); Zinckgraf y col., Vaccine 21 (15):1640-9 (2003); Ott y col., J Control Release 79 (1-3):1-5 (2002); Fynan y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90:11478 (1993)). Sin embargo, los informes de estudios en seres humanos han sido menos alentadores (véase, p. ej.,, Denis-Mize y col., Gen Ther. 7:2105 (2000)).

Por tanto, existe una necesidad de que vectores de expresión expresen secuencias heterólogas de ácido nucleico que puedan usarse como componentes de composiciones y procedimientos para estimular respuestas inmunitarias contra antígenos sobreexpresados en células cancerosas. En particular, existe la necesidad de composiciones que puedan dirigirse a una neoplasia maligna con la que un cáncer en particular está asociado, y de composiciones y procedimientos que puedan desencadenar y potenciar una respuesta inmunitaria al antígeno canceroso concreto. La presente invención satisface esta y otras necesidades.

Sumario breve de la invención

La presente invención proporciona vectores de expresión y procedimientos para la expresión de secuencias heterólogas de ácido nucleico usando tales vectores de expresión. Dentro de una realización, el vector de expresión comprende un casete de expresión que comprende los siguientes elementos, de 5' a 3': una secuencia promotora de 5 CMV, una secuencia potenciadora de CMV, una secuencia de intrón A de CMV del gen temprano inmediato principal de CMV, una secuencia heteróloga de ácido nucleico y un sitio de poliadenilación, en el que el promotor está unido de forma operable a la secuencia heteróloga de ácido nucleico. En algunas realizaciones, la secuencia de intrón A de CMV tiene una deleción desde aproximadamente la base 1513 a aproximadamente la base 1736. En otras realizaciones, el ácido nucleico heterólogo codifica un antígeno canceroso, tal como, por ejemplo, L523S (SEC ID Nº: 6). En algunas realizaciones, el casete de expresión comprende los nucleótidos 54-3675 de la secuencia establecida anteriormente en SEC ID Nº: 3, los nucleótidos 1-1653 de la secuencia establecida anteriormente en la SEC ID Nº: 3, o la secuencia de nucleótido establecida anteriormente en la SEC ID N.º: 3. La invención también proporciona células huésped que comprenden los vectores de expresión descritos anteriormente. En algunas realizaciones, la célula huésped es E. coli

o células de mamífero. La invención proporciona adicionalmente composiciones inmunogénicas que comprenden el 15 vector de expresión descrito anteriormente.

Otra realización de la invención proporciona un procedimiento para expresar una secuencia heteróloga de ácido nucleico. Una célula huésped que comprende un vector de expresión que comprende un casete de expresión que comprende de 5' a 3' los siguientes elementos: una secuencia promotora de CMV, una secuencia potenciadora de CMV, una secuencia de intrón A de CMV del gen temprano inmediato principal de CMV, una secuencia heteróloga de ácido nucleico y un sitio de poliadenilación, en el que el promotor está unido de forma operable a la secuencia heteróloga de ácido nucleico. En algunas realizaciones, la secuencia del intrón A de CMV tiene una deleción desde aproximadamente la base 1513 a aproximadamente la base 1736. En algunas realizaciones, el ácido nucleico heterólogo codifica un antígeno canceroso, tal como, por ejemplo, L523S (SEC ID Nº: 6). En algunas realizaciones, el casete de expresión comprende los nucleótidos 54-3675 de la secuencia establecida anteriormente en SEC ID Nº: 3, los nucleótidos 1-1653 de la secuencia establecida anteriormente en SEC ID Nº: 3, o la secuencia de nucleótidos establecida anteriormente en la SEC ID Nº: 3. En algunas realizaciones,... [Seguir leyendo]

1. Un vector de expresión, comprendiendo dicho vector un casete de expresión que comprende desde 5' a 3' los siguientes elementos: una secuencia promotora de citomegalovirus (CMV), una secuencia potenciadora de CMV, una secuencia de intrón A del gen temprano inmediato principal de CMV, una secuencia de ácido nucleico heterólogo y un sitio de poliadenilación, en el que el promotor está unido de forma operatible a la secuencia de ácido nucleico heterólogo, y en el que el casete se expresión comprende los nucleótidos 1-1653 de la secuencia expuesta en SEC ID Nº: 3.

2. El vector de expresión de la reivindicación 1, en el que el ácido nucleico heterólogo codifica un antígeno canceroso.

3. El vector de expresión de la reivindicación 1, en el que el casete de expresión comprende la secuencia expuesta en SEC ID Nº: 3.

4. El vector de expresión de la reivindicación 2, en el que el antígeno canceroso está codificado por la secuencia de nucleótidos expuesta en SEC ID Nº: 6.

5. Una célula huésped que comprende el vector de expresión de la reivindicación 1.

6. Una célula huésped que comprende el vector de expresión de la reivindicación 3.

7. La célula huésped de la reivindicación 5, en la que la célula huésped se selecciona del grupo que consiste en E. coli y células de mamíferos.

8. La célula huésped de la reivindicación 6, en la que la célula huésped se selecciona del grupo que consiste en E. coli y células de mamíferos.

9. Una composición que comprende un vector de expresión como se expone en la reivindicación 1.

10. Un procedimiento para expresar una secuencia de ácido nucleico heterólogo, comprendiendo el procedimiento cultivar una célula huésped que comprende un vector de expresión, comprendiendo dicho vector un casete de expresión que comprende desde 5' a 3' los siguientes elementos: una secuencia promotora de CMV, una secuencia potenciadora de CMV, una secuencia de intrón A del gen temprano inmediato principal de CMV, una secuencia de ácido nucleico heterólogo y un sitio de poliadenilación, en el que el promotor está unido de forma operable a la secuencia de ácido nucleico heterólogo, y en el que el casete se expresión comprende los nucleótidos 1-1653 de la secuencia expuesta en SEC ID Nº: 3.

11. El procedimiento de la reivindicación 10, en el que el ácido nucleico heterólogo codifica un antígeno canceroso.

12. El procedimiento de la reivindicación 10, en el que el casete de expresión comprende la secuencia expuesta en SEC ID Nº: 3.

13. El procedimiento de la reivindicación 10, en el que la célula huésped se selecciona del grupo que consiste en E. coli y células de mamíferos.

14. El procedimiento de la reivindicación 11, en el que el antígeno canceroso está codificado por la secuencia de nucleótidos expuesta en SEC ID Nº: 6.

15. La composición según la reivindicación 9 para desencadenar una respuesta inmunitaria, en la que la respuesta inmunitaria está dirigida contra un polipéptido codificado por la secuencia de ácido nucleico heterólogo.

16. La composición de la reivindicación 15, en la que la composición se administra múltiples veces.

17. El uso de una composición según la reivindicación 9 en la fabricación de un medicamento para desencadenar una respuesta inmunitaria dirigida contra un polipéptido codificado por la secuencia de ácido nucleico heterólogo.

18. Un casete de expresión que comprende los nucleótidos 1-1653 de la secuencia expuesta en SEC ID Nº: 3.

19. Un vector de expresión que comprende una secuencia de ácido nucleico heterólogo que se ha insertado en un casete de expresión según la reivindicación 18, en el que un promotor del casete de expresión está unido de forma operable a la secuencia de ácido nucleico heterólogo.

20. Un procedimiento para producir un vector de expresión para la expresión de una secuencia de ácido nucleico heterólogo, que comprende insertar una secuencia de ADN que codifica un polipéptido en un vector de expresión recombinante que comprende los nucleótidos 1-1653 se la secuencia expuesta en SEC ID Nº: 3.

21. Un procedimiento según la reivindicación 20, en el que la secuencia de ADN codifica un antígeno canceroso.