Procedimientos de producción de 4''-monofosforil lípido A 3-O-desacilado (3D-MLA).

Un procedimiento de producción de una composición de lipopolisacárido (LPS) que comprende:



(a) Cultivar un cultivo de una cepa bacteriana mutante rugosa profunda en un medio;

(b) Mantener el cultivo en fase estacionaria durante al menos 5 h;

(c) Recoger células del cultivo; y

(d) Extraer LPS de las células

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2002/009731.

Solicitante: CORIXA CORPORATION.

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: SUITE 200, 1124 COLUMBIA STREET SEATTLE, WA 98104 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: MYERS,KENT R, SNYDER,D. SCOTT.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • A61K31/739 SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA.A61 CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE.A61K PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO (dispositivos o métodos especialmente concebidos para conferir a los productos farmacéuticos una forma física o de administración particular A61J 3/00; aspectos químicos o utilización de substancias químicas para, la desodorización del aire, la desinfección o la esterilización, vendas, apósitos, almohadillas absorbentes o de los artículos para su realización A61L;   composiciones a base de jabón C11D). › A61K 31/00 Preparaciones medicinales que contienen ingredientes orgánicos activos. › Lipopolisacáridos.
  • A61P37/04 A61 […] › A61P ACTIVIDAD TERAPEUTICA ESPECIFICA DE COMPUESTOS QUIMICOS O DE PREPARACIONES MEDICINALES.A61P 37/00 Medicamentos para el tratamiento de problemas inmunológicos o alérgicos. › Inmunoestimulantes.
  • C08B37/00 SECCION C — QUIMICA; METALURGIA.C08 COMPUESTOS MACROMOLECULARES ORGANICOS; SU PREPARACION O PRODUCCION QUIMICA; COMPOSICIONES BASADAS EN COMPUESTOS MACROMOLECULARES.C08B POLISACARIDOS; SUS DERIVADOS (polisacáridos que contienen menos de seis radicales sacáridos unidos entre sí por enlaces glucosídicos C07H; procesos de fermentación o procesos que utilizan enzimas C12P 19/00; producción de celulosa D21). › Preparación de polisacáridos no previstos en los grupos C08B 1/00 - C08B 35/00; Sus derivados (celulosa D21).
  • C12N1/20 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN (biocidas, productos que repelen o atraen a los animales nocivos, o reguladores del crecimiento de los vegetales, que contienen microorganismos virus, hongos microscópicos, enzimas, productos de fermentación o sustancias obtenidas por o extraídas de microorganismos o sustancias animales A01N 63/00; preparaciones de uso médico A61K; fertilizantes C05F ); PROPAGACION,CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 1/00 Microorganismos, p.ej. protozoos; Composiciones que los contienen (preparaciones de uso médico que contienen material de protozoos, bacterias o virus A61K 35/66, de algas A61K 36/02, de hongos A61K 36/06; preparación de composiciones de uso médico que contienen antígenos o anticuerpos bacterianos, p. ej. vacunas bacterianas, A61K 39/00 ); Procesos de cultivo o conservación de microorganismos, o de composiciones que los contienen; Procesos de preparación o aislamiento de una composición que contiene un microorganismo; Sus medios de cultivo. › Bacterias; Sus medios de cultivo.
  • C12N1/21 C12N 1/00 […] › modificados por la introducción de material genético extraño.
  • C12P1/04 C12 […] › C12P PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN ENZIMAS PARA LA SINTESIS DE UN COMPUESTO QUIMICO DADO O DE UNA COMPOSICION DADA, O PARA LA SEPARACION DE ISOMEROS OPTICOS A PARTIR DE UNA MEZCLA RACEMICA.C12P 1/00 Preparación de compuestos o de composiciones, no prevista en los grupos C12P 3/00 - C12P 39/00, utilizando microorganismos o enzimas; Procedimientos generales de preparación de compuestos o composiciones que utilizan microorganismos o enzimas. › utilizando bacterias.
  • C12P19/04 C12P […] › C12P 19/00 Preparación de compuestos que contienen radicales sacárido (ácido cetoaldónico C12P 7/58). › Polisacáridos, es decir, compuestos que contienen más de cinco radicales sacárido unidos entre ellos por enlaces glucosídicos.

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Fragmento de la descripción:

Procedimientos de producción de 4'-monofosforil lípido A 3-O-desacilado (3D-MLA) .

Antecedentes de la invención

1. Campo de la invención La presente invención se refiere en general, al campo de la producción biosintética de 4'-monofosforil lípido A 3-Odesacilado (3D-MLA) . Más particularmente, se refiere a procedimientos de mejora del rendimiento de congéneres de 3D-MLA deseados o minimización del coste de purificación de precursores de lipopolisacárido (LPS) de 3D-MLA.

2. Descripción de técnica relacionada Desde hace tiempo se reconoce que los lipopolisacáridos enterobacterianos (LPS) son potentes estimulantes del sistema inmunitario. Puede provocarse una variedad de respuestas, tanto beneficiosas como perjudiciales, por cantidades de submicrogramo de LPS. El hecho de que algunas de las respuestas sean perjudiciales, y algunas de éstas puedan ser mortales, ha descartado el uso clínico de LPS por sí mismo. Se ha observado que el componente de LPS más responsable de la actividad endotóxica es el lípido A.

Por consiguiente, se ha hecho un gran esfuerzo por atenuar los atributos tóxicos de LPS o lípido A sin disminuir los beneficios inmunoestimulantes de estos compuestos. Entre estos esfuerzos fueron notables los de Edgar Ribi y sus colaboradores, que dieron como resultado la producción del derivado de lípido A 4'-monofosforil lípido A 3-O-desacilado (3D-MLA; composiciones que comprenden 3D-MLA están comercialmente disponibles bajo el nombre comercial MPL® de Corixa Corporation (Seattle, WA) ) . Se ha mostrado que 3D-MLA tiene esencialmente las mismas propiedades inmunoestimulantes que el lípido A, pero menor endotoxicidad (Myers y col., patente de EE.UU. nº 4.912.094) . Myers y col. también informaron del siguiente procedimiento para la producción de 3D-MLA. Primero, LPS o lípido A obtenido de una cepa mutante rugosa profunda de una bacteria Gram-negativa (por ejemplo, R595 de Salmonella minnesota) se somete a reflujo en disoluciones de ácido mineral de concentración moderada (por ejemplo, HCl 0, 1 N) durante un periodo de aproximadamente 30 min. Esto conduce a la desfosforilación en la posición 1 de la glucosamina del extremo reductor y a la descarbohidratación en la posición 6' de la glucosamina no reductora del lípido A. Segundo, el lípido A descarbohidratado desfosforilado (también conocido como monofosforil lípido A o MLA) se somete a una hidrólisis básica, por ejemplo, disolviendo en un disolvente orgánico tal como cloroformo:metanol (CM) 2:1 (v/v) , saturando la disolución con una disolución acuosa de Na2CO3 0, 5 M a pH 10, 5 y evaporando al vacío el disolvente. Esto conduce a eliminación selectiva del resto ácido β-hidroximirístico en la posición 3 del lípido A, resultando 4'-monofosforil lípido A 3O-desacilado (3D-MLA) .

La calidad del 3D-MLA producido mediante el procedimiento anterior es altamente dependiente de la pureza y composición del LPS obtenido de la bacteria Gram-negativa. Por ejemplo, el componente de lípido A de LPS es una mezcla de especies estrechamente relacionadas que contienen entre aproximadamente 5-7 restos de ácido graso. En la formación de 3D-MLA, como es evidente de la discusión anterior, un resto de ácido graso se elimina, dando 3D-MLA con entre aproximadamente 4-6 restos de ácido graso. Se mantiene generalmente que 3D-MLA con al menos 6 restos de ácido graso se prefiere en términos de la combinación de beneficios inmunoestimulantes mantenidos o potenciados, toxicidad reducida y otras propiedades deseables (Qureshi y Takayama, en “The Bacteria, ” vol. XI (Iglewski y Clark, eds.) , Academic Press, 1990, pág. 319-338) .

Otro ejemplo, la extracción a escala comercial de LPS de bacterias Gram-negativas normalmente implica el procedimiento de Chen (Chen y col., J. Infect. Dis. 128:543 (1973) ) ; concretamente la extracción con CM, que conduce a una fase de CM rica en LPS y fosfolípidos de la que luego puede purificarse el LPS. Sin embargo, la purificación de LPS de la fase de CM rica en LPS y fosfolípidos normalmente requiere múltiples etapas de precipitación para obtener LPS de suficiente pureza para su uso en aplicaciones inmunoestimulantes tales como, por ejemplo, uso como adyuvante de vacuna.

Por tanto, sería deseable disponer de procedimientos para preparar convenientemente composiciones de LPS altamente puras. Además, sería deseable disponer de procedimientos para generar composiciones de LPS cuyas composiciones tuvieran 3D-MLA con niveles elevados de congéneres de hexaacilo.

Se han usado técnicas de fermentación conocidas para preparar cultivos de bacterias Gram-negativas que comprenden LPS fácilmente purificables. Estas técnicas conocidas normalmente implican recoger cultivos bacterianos en fase estacionaria temprana, de acuerdo con prácticas bacteriológicas convencionales. Sin embargo, se ha observado que el grado de acilación del LPS producido según condiciones conocidas es variable. Por ejemplo, el contenido de especies de heptaacilo en el lípido A de R595 de S. minnesota puede variar del 20% al 80%, dependiendo del lote (Rietschel y col., Rev. Infect. Dis. 9:S527 (1987) ) . Esta variabilidad en el contenido de congéneres de heptaacilo produciría diferencias significativas en el contenido de congéneres de hexaacilo en el 3D-MLA preparado a partir de estos lotes de LPS.

Sumario de la invención En una realización, la presente invención se refiere a un procedimiento de producción de lipopolisacárido (LPS) que comprende:

(a) cultivar un cultivo de una cepa bacteriana mutante rugosa profunda en un medio;

(b) mantener el cultivo en fase estacionaria durante al menos aproximadamente 2 h;

(c) recoger células del cultivo; y

(d) extraer LPS de las células.

El procedimiento permite la producción de un LPS que da 3D-MLA con una proporción relativamente alta (es decir, al menos aproximadamente el 20% en moles) de congéneres que comprenden 6 restos de ácido graso.

Breve descripción de los dibujos Los siguientes dibujos forman parte de la memoria descriptiva y están incluidos para demostrar adicionalmente ciertos aspectos de la presente invención. La invención puede entenderse mejor por referencia a uno o más de estos dibujos en combinación con la descripción detallada de realizaciones específicas presentadas en el presente documento.

La Figura 1 muestra placas de CCF de extractos de etanol y muestras de LPS obtenidas con diferentes temperaturas durante las extracciones con etanol. La placa de la izquierda muestra, de izquierda a derecha, los extractos de etanol a temperaturas de 22 ºC, 37 ºC y 50 ºC. La muestra de la derecha de esta placa es una muestra de LPS auténtica. La placa a la derecha muestra el LPS obtenido de cada preparación. Las muestras en los carriles 3, 4 y 5 se corresponden con LPS de células sometidas a pre-extracciones con etanol a 22 ºC, 37 ºC y 50 ºC, respectivamente. Las bandas pesadas a Rf~0, 6 se corresponden con fosfolípido e impurezas de ácidos grasos. Los niveles de estas impurezas se reducen aumentando la temperatura de las extracciones con etanol, y son muy bajos en la muestra que se pre-extrajo a 50 ºC.

Descripción de realizaciones ilustrativas

En una realización, la presente invención se refiere a un procedimiento para la producción de lipopolisacárido (LPS) que comprende:

(a) cultivar un cultivo de una cepa bacteriana mutante rugosa profunda en un medio;

(b) mantener el cultivo en fase estacionaria durante al menos aproximadamente 2 h;

(c) recoger células del cultivo; y

(d) extraer LPS de las células.

Los lipopolisacáridos son el principal lípido constituyente en la valva externa de la membrana externa de bacterias Gram-negativas. La fracción de lipopolisacáridos de una bacteria Gram-negativa comprende, entre otros componentes, lípido A. Como se ha descrito, el lípido A puede descarbohidratarse y desfosforilarse parcialmente para dar monofosforil lípido A (MLA) , y MLA puede desacilarse selectivamente en la posición 3 para dar 4'-monofosforil lípido A 3-O-desacilado (3D-MLA) .

Sin embargo, el lípido A producido por bacterias Gram-negativas normalmente comprende varias especies que tienen la misma estructura de lípido A global, pero se diferencian en el número de restos de ácido graso que contienen. Grupos de especies del lípido A con el mismo número de ácidos grasos se denominan en el presente documento “congéneres”. Los congéneres del lípido A que tienen de 4 a 7 restos de ácido graso se producen por cultivo a escala comercial convencional de bacterias Gram-negativas tales como R595 de S. minnesota. Como resultado, 3D-MLA producido de, por ejemplo, lípido A de R595 de... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un procedimiento de producción de una composición de lipopolisacárido (LPS) que comprende:

(a) Cultivar un cultivo de una cepa bacteriana mutante rugosa profunda en un medio;

(b) Mantener el cultivo en fase estacionaria durante al menos 5 h; 5 (c) Recoger células del cultivo; y

(d) Extraer LPS de las células 2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la cepa bacteriana mutante rugosa profunda es del género Salmonella

3. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que la cepa bacteriana mutante rugosa profunda del género 10 Salmonella es de la especie Salmonella minnesota

4. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que la cepa bacteriana mutante rugosa profunda de la especie Salmonella minnesota es la cepa R595 de Salmonella minnesota

5. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el medio es M9.

6. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el mantenimiento se realiza durante entre 5 15 h y aproximadamente 6 h.

7. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el LPS puede usarse para producir un monofosforil lípido A 3-O-desacilado que tiene al menos el 20% en moles del grupo de congéneres de hexaacilo.

8. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones a 7 que comprende además someter el LPS a hidrólisis ácida e hidrólisis básica secuenciales para formar monofosforil lípido A 3-O-desacilado.


 

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