ANTÍGENO MTB32A DE MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS CON EL SITIO ACTIVO INACTIVADO Y PROTEÍNAS DE FUSIÓN DE LOS MISMOS.

Antígeno MTB32A de Mycobacterium tuberculosis con el sitio activo inactivado y proteínas de fusión de los mismos. Campo de la invención La presente invención se refiere a antígenos de Mycobacterium sp. En particular, se refiere a ácidos nucleicos que codifican antígenos individuales de M. tuberculosis que aumentan la sensibilidad serológica de los sueros de individuos infectados con tuberculosis, y a su uso en el diagnóstico, tratamiento y prevención de infección por tuberculosis. Antecedentes de la invención La tuberculosis es una enfermedad infecciosa crónica causada por infección con M. tuberculosis y otras especies de Mycobacterium. Es una enfermedad importante en los países en desarrollo, así como un problema creciente en las zonas desarrolladas del mundo, con aproximadamente 8 millones de casos nuevos y 3 millones de muertes cada año. Aunque la infección puede ser asintomática durante un periodo considerable de tiempo, la enfermedad se manifiesta lo más comúnmente como una inflamación aguda de los pulmones, dando como resultado fiebre y una tos improductiva. Si no se trata, da como resultado típicamente complicaciones graves y muerte. Aunque la tuberculosis puede controlarse generalmente usando una terapia de antibióticos extendida, dicho tratamiento no es suficiente para prevenir la difusión de la enfermedad. Los individuos afectados pueden ser asintomáticos, pero contagiosos, durante algún tiempo. Además, aunque el cumplimiento del régimen de tratamiento es crítico, el comportamiento del paciente es difícil de monitorizar. Algunos pacientes no completan el curso del tratamiento, lo que puede conducir a un tratamiento ineficaz y al desarrollo de resistencia a fármacos. Para controlar la difusión de la tuberculosis, la vacunación eficaz y el diagnóstico temprano exacto de la enfermedad son de la máxima importancia. Actualmente, la vacunación con bacterias vivas es el método más eficaz para inducir inmunidad protectora. La micobacteria más común empleada con este fin es el bacilo de Calmette-Guerin (BCG), una cepa avirulenta de M. bovis. Sin embargo, la seguridad y eficacia del BCG es fuente de controversia y algunos países, tales como los Estados Unidos, no vacunan al público general con este agente. El diagnóstico de la tuberculosis se consigue comúnmente usando un ensayo cutáneo, que implica la exposición intradérmica a tuberculina DPP (derivado de proteína purificado). Las respuestas de linfocitos T específicas de antígeno dan como resultado una induración mensurable en el sitio de inyección durante 48-72 horas después de la inyección, que indica exposición a antígenos micobacterianos. Sin embargo, la sensibilidad y especificidad han sido problemáticos con este ensayo, y los individuos vacunados con BCG no pueden distinguirse de los individuos infectados. Aunque se ha mostrado que los macrófagos actúan como los efectores principales de la inmunidad por Mycobacterium, los linfocitos T son los inductores predominantes de dicha inmunidad. El papel esencial de los linfocitos T en la protección frente a infección por Mycobacterium se ilustra por la frecuente aparición de infección por Mycobacterium en pacientes de SIDA, debido al agotamiento de linfocitos T CD4 + asociado a la infección por virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). Se ha mostrado que los linfocitos T CD4 + reactivos con Mycobacterium son potentes productores de interferón (IFN -) que, a su vez, se ha mostrado que desencadena los efectos antimicobacterianos de los macrófagos en ratones. Aunque el papel del IFN- en seres humanos está menos claro, los estudios han mostrado que la 1,25-dihidroxivitamina D3, sola o en combinación con IFN- o factor alfa de necrosis tumoral, activa los macrófagos humanos para inhibir la infección por M. tuberculosis. Además, es conocido que el IFN- estimula a los macr ófagos humanos a preparar 1,25 -dihidroxivitamina D3. De forma similar, se ha mostrado que la interleucina-12 (IL-12) desempeña un papel en la estimulación de la resistencia a infección por M. tuberculosis. Para una revisión de la inmunología de infección por M. tuberculosis, véanse Chan y Kaufmann, Tuberculosis: Pathogenesis, Protection and Control (Bloom ed., 1994) y Harrisons Principles of Internal Medicine, volumen 1, pág. 1004-1014 y 1019-1023 (14ª ed., Fauci et al., eds., 1998). Skeiky et al., Infection and Immunity 1999, 67(8): 3998-4007 describe la clonación, expresión y evaluación inmunológica de dos supuestos antígenos de serina proteasa secretados de Mycobacterium tuberculosis, identificando la triada catalítica de histidina, ácido aspártico y serina (correspondiente a los residuos 95, 126 y 208 respectivamente de la SEQ ID Nº 2 de la presente memoria). En consecuencia, existe la necesidad de reactivos de diagnóstico mejorados y métodos mejorados para el diagnóstico, prevención y tratamiento de la tuberculosis. Sumario de la invención En un aspecto, la presente invención proporciona polipéptidos y proteínas de fusión que comprenden una versión mutada de MTB32A, en que uno, dos o tres de los tres aminoácidos histidina, aspartato o serina en el sitio activo se han mutado a un aminoácido diferente. En una realización, en Ra35FL, la serina en posición 183 se ha mutado a un residuo de alanina, creando Ra35FLMutSA. En una realización, el ADN que codifica Ra35FL se ha mutado 2   cambiando una T por G, dando como resultado una mutación de serina a alanina en el aminoácido 183 de la SEQ ID Nº 4. La presente invención está basada, en parte, en el descubrimiento por los inventores de que los polinucleótidos de fusión, polipéptidos de fusión o composiciones que contienen al menos dos secuencias de codificación heterólogas de M. tuberculosis o antígenos son altamente antigénicos y, tras administración a un paciente, aumentan la sensibilidad a sueros de tuberculosis. Además, las composiciones, polipéptidos y polinucleótidos de fusión son útiles como herramientas de diagnóstico en pacientes que pueden haberse infectado con Mycobacterium. Los polipéptidos, polipéptidos de fusión y ácidos nucleicos de la invención se usan en ensayos in vitro e in vivo para detectar anticuerpos humorales o inmunidad mediada por célula contra M. tuberculosis para el diagnóstico de infección o la monitorización de la progresión de la enfermedad. Por ejemplo, los polipéptidos pueden usarse como agente de diagnóstico in vivo en forma de un ensayo cutáneo intradérmico. Los polipéptidos pueden usarse también en ensayos in vitro tales como ELISA con suero de paciente. Como alternativa, los ácidos nucleicos, composiciones y polipéptidos de fusión pueden usarse para crear anticuerpos anti-M. tuberculosis en un animal no humano. Los anticuerpos pueden usarse para detectar los antígenos diana in vivo e in vitro. Los polipéptidos, polipéptidos de fusión y ácidos nucleicos pueden usarse como inmunógenos para generar o provocar una respuesta inmunitaria protectora en un paciente. Se usan polinucleótidos aislados o purificados para producir antígenos de polipéptido recombinante de fusión in vitro, que se administran entonces en forma de vacuna. Como alternativa, los polinucleótidos pueden administrarse directamente a un sujeto en forma de vacunas de ADN para causar la expresión de antígeno en el sujeto y la posterior inducción de una respuesta inmunitaria anti-M. tuberculosis. Por tanto, los polipéptidos y ácidos nucleicos de M. tuberculosis aislados o purificados de la invención pueden formularse en forma de composiciones farmacéuticas para administración a un sujeto en la prevención y/o el tratamiento de infección por M. tuberculosis. La inmunogenicidad de la proteína de fusión o antígenos puede potenciarse mediante la inclusión de un coadyuvante, así como polipéptidos de fusión adicionales, de Mycobacterium u otros organismos, tales como polipéptidos bacterianos, víricos o de mamífero. Pueden incluirse también polipéptidos adicionales en las composiciones, ligados o no ligados al polipéptido de fusión. Breve descripción de los dibujos La Figura 1 muestra el porcentaje de supervivencia de conejillos de Indias vacunados con poliproteína MTB72F. La Figura 2 muestra las UFC de células de bazo (Fig. 2A) y células pulmonares después de inmunización con MTB72F, MTB59F, ADN de MTB72F o una composición que comprende los antígenos Ra12, TbH9, y Ra35. La Figura 3 muestra un diagrama esquemático de MTB72F. La Figura 4 muestra la secuencia nucleotídica y aminoacídica de Ra35 (195 aminoácidos de la porción N-terminal de MTB32A). La Figura 5 muestra un alineamiento de las secuencias aminoacídicas de MTB72F y la versión mutada MTB72FMutSA. La Figura 6 muestra un alineamiento de las secuencias aminoacídicas de Ra35/MTB32A madura (completa) y la versión mutada Ra35FLMutSA. La Figura 7 muestra la supervivencia a largo plazo... [Seguir leyendo]

1. Un ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende un antígeno MTB32A de una especie de Mycobacterium del complejo de tuberculosis, en el que al menos un aminoácido de la triada del sitio activo del antígeno MTB32A (SEQ ID Nº 2 o 4) se ha sustituido por un aminoácido diferente. 2. El ácido nucleico de la reivindicación 1, en el que un residuo de serina correspondiente a la posición aminoacídica 183 de la SEQ ID Nº 4 o la posición 208 de la SEQ ID Nº 2 se ha sustituido por otro aminoácido. 3. El ácido nucleico de la reivindicación 1, en el que se ha sustituido un residuo de alanina por un residuo de serina. 4. El ácido nucleico de la reivindicación 4, en el que el ácido nucleico comprende una secuencia nucleotídica de SEQ ID Nº 5. 5. Una composición farmacéutica que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 1. 6. Un ácido nucleico que codifica un polipéptido de fusión que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 1. 7. Un polipéptido que comprende un polipéptido MTB32A de una especie de Mycobacterium del complejo de tuberculosis, en el que al menos un aminoácido de la triada del sitio activo del antígeno MTB32A (SEQ ID Nº 2 o 4) se ha sustituido por un aminoácido diferente. 8. El polipéptido de la reivindicación 7, en el que un residuo de serina correspondiente a la posición aminoacídica 183 de la SEQ ID Nº 4 o la posición 208 de la SEQ ID Nº 2 se ha sustituido por otro aminoácido. 9. El polipéptido de la reivindicación 8, en el que se ha sustituido un residuo de alanina por un residuo de serina. 10. Un polipéptido de la reivindicación 9, en el que el polipéptido comprende una secuencia aminoacídica de SEQ ID Nº 6. 11. Una composición farmacéutica que comprende el polipéptido de la reivindicación 7. 12. Un polipéptido de fusión que comprende el polipéptido de la reivindicación 7. 13. Un ácido nucleico que codifica un polipéptido de fusión que comprende un antígeno MTB39 (SEQ ID Nº 12 o 14) de una especie de Mycobacterium del complejo de tuberculosis y un antígeno que comprende al menos 195 aminoácidos del extremo N de un antígeno MTB32A (SEQ ID Nº 2 o 4) de una especie de Mycobacterium del complejo de tuberculosis, en el que un aminoácido de la triada del sitio activo del antígeno MTB32A (SEQ ID Nº 2 o 4) se ha sustituido por un aminoácido diferente. 14. El ácido nucleico de la reivindicación 13, en el que se ha sustituido un residuo de serina correspondiente al aminoácido en la posición 183 de la SEQ ID Nº 4 o la posición 208 de la SEQ ID Nº 2 por otro aminoácido. 15. El ácido nucleico de la reivindicación 14, en el que se ha sustituido un residuo de alanina por un residuo de serina. 16. Una composición farmacéutica que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 13. 17. Un ácido nucleico que codifica un polipéptido de fusión que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 13. 18. Un ácido nucleico que codifica un polipéptido de fusión, en el que el ácido nucleico comprende una secuencia nucleotídica de SEQ ID Nº 17. 19. Un polipéptido de fusión que comprende un antígeno MTB39 (SEQ ID Nº 12 o 14) de una especie de Mycobacterium del complejo de tuberculosis y un antígeno que comprende al menos 195 aminoácidos del extremo N de un antígeno MTB32A (SEQ ID Nº 2 o 4) de una especie de Mycobacterium del complejo de tuberculosis, en el que un aminoácido de la triada del sitio activo del antígeno MTB32A (SEQ ID Nº 2 o 4) se ha sustituido por un aminoácido diferente. 20. El polipéptido de la reivindicación 19, en el que se ha sustituido un residuo de resina correspondiente a la posición aminoacídica 183 de la SEQ ID Nº 4 o la posición aminoacídica 208 de la SEQ ID Nº 2 por otro aminoácido. 21. El polipéptido de la reivindicación 19, en el que se ha sustituido un residuo de alanina por un residuo de serina. 22. Una composición farmacéutica que comprende el polipéptido de la reivindicación 19.   96   97   98   99     101   102   103   104