PURIFICACION POR AFINIDAD DE POLIPEPTIDO EN UNA MATRIZ DE PROTEINA A.

Procedimiento para purificar un anticuerpo anti-VEGF o un fragmento de anticuerpo que comprende la región de unión a antígeno del mismo,

que comprende una región CH2/CH3, a partir de una solución contaminada del mismo, por medio de cromatografía con Proteína A, que comprende:

(a) adsorber el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo a la Proteína A inmovilizada sobre una fase sólida que comprende sílice o vidrio;

(b) eliminar los contaminantes unidos a la fase sólida, mediante lavado de la fase sólida con un disolvente electrolito hidrofóbico, en donde el disolvente electrolito hidrofóbico comprende cloruro de tetrapropilamonio, cloruro de tetrabutilamonio, cloruro de tetrametilamonio (TMAC) o cloruro de tetraetilamonio (TEAC); y

(c) recuperar el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo a partir de la fase sólida

Purificación por afinidad de polipéptido en una matriz de Proteína A.

Antecedentes de la invención

La presente invención se refiere en general a la purificación de proteínas. En particular, la presente invención se refiere a un procedimiento para purificar un anticuerpo anti-VEGF o un fragmento de anticuerpo que comprende la región de unión a antígeno del mismo, que comprende una región CH2/CH3 a través de cromatografía de afinidad con Proteína A.

La purificación económica de proteínas, a gran escala, se está convirtiendo en un problema de creciente importancia para la industria biotecnológica. Generalmente, las proteínas son producidas a través de cultivo celular, utilizando o bien líneas celulares bacterianas o de mamífero, diseñadas para producir la proteína de interés, por medio de la inserción de un plásmido recombinante que contiene el gen para esa proteína. Dado que las líneas celulares utilizadas son organismos vivos, las mismas tienen que ser alimentadas con un medio de crecimiento complejo, que contiene azúcares, aminoácidos y factores del crecimiento, suministrado habitualmente a partir de preparaciones de suero animal. La separación de la proteína deseada de la mezcla de compuestos proporcionada como alimento a las células y de los subproductos de las propias células hasta lograr un grado de pureza suficiente para un uso terapéutico constituye un desafío formidable.

Los procedimientos para la purificación de proteínas a partir de residuos celulares dependen inicialmente del sitio de expresión de la proteína. Se puede lograr el que algunas proteínas sean secretadas directamente desde la célula en el medio de crecimiento del entorno; otras se obtienen intracelularmente. Para estas últimas, el primer paso de un procedimiento de purificación conlleva la lisis de la célula, la cual puede ser efectuada a través de una diversidad de procedimientos, incluyendo la rotura mecánica, el shock osmótico o los tratamientos enzimáticos. La citada interrupción libera el contenido completo de la célula en el homogenado y, además, genera fragmentos subcelulares que son difíciles de eliminar debido a su pequeño tamaño. Estos son generalmente eliminados a través de centrifugación diferencial o a través de filtración. El mismo problema surge, aunque a escala más pequeña, con las proteínas directamente secretadas, debido a la muerte natural de las células y a la liberación de proteínas de célula huésped intracelular en el transcurso del proceso de producción de la proteína.

Una vez se ha obtenido una solución clara que contiene la proteína de interés, su separación de las otras proteínas producidas por la célula es habitualmente intentada utilizando una combinación de diferentes técnicas de cromatografía. Estas técnicas separan mezclas de proteínas en base a su carga, a su grado de hidrofobicidad o su tamaño. Para cada una de estas técnicas se dispone de diversas resinas cromatográficas, las cuales permiten la adaptación ajustada del esquema de purificación a la proteína involucrada en particular. La esencia de cada uno de estos procedimientos de separación reside en el hecho de que las proteínas pueden ser o bien desplazadas en sentido descendente, a diferentes velocidades, a lo largo de una columna larga, lográndose una separación física que se incrementa a medida que desciende adicionalmente por la columna, o bien adherirse selectivamente al medio de separación, siendo después eluidas diferencialmente a través de diferentes disolventes. En algunos casos, la proteína seseada es separada de las impurezas cuando las impurezas se adhieren específicamente a la columna y la proteína de interés no lo hace, es decir, la proteína de interés está presente en el "eluido".

La cromatografía por afinidad, la cual explota una interacción específica entre la proteína que tiene que ser purificada y un agente de captura inmovilizado, puede constituir también una opción para algunas proteínas. La Proteína A en un adsorbente de utilidad para la cromatografía por afinidad de proteínas, tales como anticuerpos, que contienen una región Fc. La Proteína A es una proteína de la pared celular de 41 kD, procedente de Staphylococcus aureas, la cual se une con elevada afinidad (aproximadamente 10^-8M para IgG humana) a la región Fc de anticuerpos.

Descripción resumida de la invención

Un problema asociado a la cromatografía con Proteína A de preparaciones de proteínicas contaminadas ha sido identificado en el presente documento. En particular, se ha observado que en la cromatografía con Proteína A que utiliza una superficie de sílice o de vidrio para la adsorción de los contaminantes de la Proteína A (por ejemplo, cuando la Proteína A es inmovilizada sobre una columna de vidrio de poro controlado o sobre una columna de ácido silícico), la preparación proteínica (tal como proteínas de Ovario de Hámster Chino (CHOP), en la que la preparación proteínica procede de una célula CHO), se adhiere a la superficie de sílice o de vidrio de la fase sólida. Se averiguó que esto ocurría incluso cuando la fase sólida estaba revestida con un reactivo (tal como glicerol) en un intento para evitar la adherencia no específica a la misma. Para solucionar este problema en el presente caso, se ha pensado en un paso de lavado intermedio. Este paso de lavado sirve para eliminar los contaminantes, pero no la Proteína A inmovilizada o la proteína de interés unida a la Proteína A, procedente de la fase sólida. En particular, se ha averiguado que en este paso de lavado intermedio pueden utilizarse electrolitos hidrofóbicos, por ejemplo, cloruro de tetrametilamonio (TMAC) y cloruro de tetraetilamonio (TEAC).

Por consiguiente, la invención proporciona un procedimiento para la purificación de un anticuerpo anti-VEGF o un fragmento de anticuerpo que comprende la región de unión a antígeno del mismo, que comprende una región CH2/CH3, a partir de una solución contaminada del mismo, por medio de cromatografía con Proteína A, que comprende los siguientes pasos, llevados a cabo de forma secuencial: (a) adsorber el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo a la Proteína A inmovilizada sobre una fase sólida que comprende sílice o vidrio; (b) eliminar los contaminantes unidos a la fase sólida mediante el lavado de la fase sólida con un disolvente electrolito hidrofóbico, en donde el disolvente electrolito hidrofóbico comprende cloruro de tetrapropilaminio, cloruro de tetrabutilamonio, cloruro de tetrametilamonio (TMAC) o cloruro de tetraetilamonio (TEAC); y (c) recuperar el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo a partir de la fase sólida.

Descripción detallada de las realizaciones preferidas

Definiciones

Cuando se utiliza en el presente documento, el término "Proteína A" abarca la Proteína A recuperada a partir de una de sus fuentes de origen natural, la Proteína A producida de forma sintética (por ejemplo, mediante síntesis peptídica o a través de técnicas recombinantes), y variantes de la misma que retienen la capacidad de unión a proteínas que tienen una región C_H2/C_H3. La Proteína A puede ser adquirida comercialmente en Repligen, Pharmacia y Fermatech.

La Proteína A es inmovilizada sobre una fase sólida. Por "fase sólida" se entiende una matriz no acuosa a la cual puede adherirse la Proteína A. La fase sólida de interés en el presente documento es una que comprende una superficie de sílice o de vidrio. La fase sólida puede ser una columna de purificación o una fase discontinua de partículas discretas. En realizaciones preferidas, la fase sólida es una columna de vidrio de poro controlado o una columna de ácido silícico. En determinadas realizaciones, la fase sólida está revestida con un reactivo (tal como glicerol), el cual pretende evitar la adherencia no específica de contaminantes a la fase sólida.

La proteína de interés en el presente documento es un anticuerpo anti-VEGF o un fragmento de anticuerpo que comprende la región de unión a antígeno del mismo, que comprende una región C_H2/C_H3 y, por tanto, es susceptible de ser purificado por medio de cromatografía con Proteína A. El término "región C_H2/C_H3", cuando se utiliza en el presente documento, hace referencia a aquellos restos de aminoácido en la región Fc de una molécula inmunoglobulina que interaccionan con la proteína A. En realizaciones preferidas, la región C_H2/C_H3 comprende una región C_H2...

1. Procedimiento para purificar un anticuerpo anti-VEGF o un fragmento de anticuerpo que comprende la región de unión a antígeno del mismo, que comprende una región C_H2/C_H3, a partir de una solución contaminada del mismo, por medio de cromatografía con Proteína A, que comprende:

(a) adsorber el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo a la Proteína A inmovilizada sobre una fase sólida que comprende sílice o vidrio;

(b) eliminar los contaminantes unidos a la fase sólida, mediante lavado de la fase sólida con un disolvente electrolito hidrofóbico, en donde el disolvente electrolito hidrofóbico comprende cloruro de tetrapropilamonio, cloruro de tetrabutilamonio, cloruro de tetrametilamonio (TMAC) o cloruro de tetraetilamonio (TEAC); y

(c) recuperar el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo a partir de la fase sólida.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el disolvente electrolito hidrofóbico comprende cloruro de tetrametilamonio (TMAC).

3. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la fase sólida es una columna de vidrio de poro controlado.

4. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la fase sólida es una columna de ácido silícico.

5. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que los contaminantes son proteínas de Ovario de Hámster Chino (CHOP).

6. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la concentración del electrolito hidrofóbico en el disolvente electrolito hidrofóbico se encuentra en el intervalo entre aproximadamente 0,1 y aproximadamente 1,0 M.

7. Procedimiento según la reivindicación 6, en el que la concentración de electrolito hidrofóbico en el disolvente electrolito hidrofóbico se encuentra en el intervalo entre aproximadamente 0,25 y aproximadamente 0,5 M.

8. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el pH del disolvente electrolito hidrofóbico se encuentra en el intervalo entre aproximadamente 4 y aproximadamente 8.

9. Procedimiento según la reivindicación 8, en el que el pH del disolvente electrolito hidrofóbico se encuentra en el intervalo entre aproximadamente 5 y aproximadamente 7.

10. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el paso (c) comprende eluir el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo utilizando un tampón de elución que tiene un pH en el intervalo entre aproximadamente 2,0 y aproximadamente 5,0.

11. Procedimiento según la reivindicación 10, en el que el paso (c) comprende eluir el anticuerpo o el fragmento de anticuerpo utilizando un tampón de elución que tiene un pH en el intervalo entre aproximadamente 2,5 y aproximadamente 3,5.