COMPOSICION FARMACEUTICA DE FRAGMENTOS F(AB)2 DE ANTICUERPOS Y METODO PARA LA PREPARACION DE LOS MISMOS.
La presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende fragmentos F(ab)2 de anticuerpos que preferentemente se encuentran libres de albúmina y de anticuerpos completos y también sustancialmente libre de pirógenos,
y una cantidad efectiva de un acarreador farmacéuticamente aceptable. También se refiere a un método para la preparación de una composición farmacéutica que comprende fragmentos F(ab)2 de anticuerpos utilizando el suero o plasma de sangre de un mamífero, previamente inmunizado, como fuente de anticuerpos. El suero o plasma de sangre se digiere con una enzima, pepsina, seguido por la separación y purificación hasta que la composición farmacéutica de los fragmentos F(ab)2 quede libre de albúmina y anticuerpos completos, y sustancialmente libres de pirógenos
Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/MX02/00013.
Solicitante: INSTITUTO BIOCLON S.A. DE CV.
Nacionalidad solicitante: México.
Dirección: CALZADA DE TLALPAN NO. 4687 COL. TORIELLO GUERRA DELEGACION TLALPAN,14050 MEXICO, D.F.
Inventor/es: JORGE F. PANIAGUA SOLIS, RITA MANCILLA NAVA, JUAN LOPEZ DE SILANES.
Fecha de Publicación: .
Fecha Concesión Europea: 30 de Junio de 2010.
Clasificación Internacional de Patentes:
- C07K16/06A
- C07K16/18 QUIMICA; METALURGIA. › C07 QUIMICA ORGANICA. › C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02; proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 16/00 Inmunoglobulinas, p. ej. anticuerpos mono o policlonales. › contra materiales animales o humanos.
- C07K16/24B
- C07K16/24H
Clasificación PCT:
- A61K39/395 NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA. › A61 CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE. › A61K PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO (dispositivos o métodos especialmente concebidos para conferir a los productos farmacéuticos una forma física o de administración particular A61J 3/00; aspectos químicos o utilización de substancias químicas para, la desodorización del aire, la desinfección o la esterilización, vendas, apósitos, almohadillas absorbentes o de los artículos para su realización A61L; composiciones a base de jabón C11D). › A61K 39/00 Preparaciones medicinales que contienen antígenos o anticuerpos (materiales para ensayos inmunológicos G01N 33/53). › Anticuerpos (aglutininas A61K 38/36 ); Inmunoglobulinas; Inmunosuero, p. ej. suero antilinfocitario.
- C07K16/18 C07K 16/00 […] › contra materiales animales o humanos.
Clasificación antigua:
- A61K39/395 A61K 39/00 […] › Anticuerpos (aglutininas A61K 38/36 ); Inmunoglobulinas; Inmunosuero, p. ej. suero antilinfocitario.
- C07K16/18 C07K 16/00 […] › contra materiales animales o humanos.
Fragmento de la descripción:
Composición farmacéutica de fragmentos F(ab)2 de anticuerpos y método para la preparación de los mismos.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende fragmentos F(ab)2 de anticuerpos que se encuentran libres de albumina y de anticuerpos completos y también libres de pirógenos, y una cantidad efectiva de un acarreador farmacéuticamente aceptable. También se refiere a un método para la preparación de una composición farmacéutica que comprende fragmentos F(ab)2 de anticuerpos utilizando el suero o plasma de sangre de un mamífero, previamente inmunizado, como fuente de anticuerpos. El suero o plasma de sangre se digiere con una enzima, pepsina, seguido por la separación y purificación hasta que la composición farmacéutica de los fragmentos F(ab)2 quede libre de albúmina y anticuerpos completos, y libre de pirógenos.
Antecedentes
Los anticuerpos son proteínas tipo globulinas conocidas como inmunoglobulinas, que se encuentran presentes en el suero sanguíneo como respuesta del sistema inmune a la invasión de alguna sustancia u organismo ajeno, que se caracterizan por unir específicamente aquellas sustancia ajenas al organismo, neutralizándolas y precipitándolas, con cual son eliminadas de la circulación. Con ellos, se han desarrollado diversas aplicaciones industriales para el diagnóstico, monitoreo, prevención y tratamiento de diversos padecimientos.
En regiones donde, por las condiciones climáticas, abundan los animales ponzoñosos, a los anticuerpos se les ha dado un especial uso para combatir el veneno, aplicándolos en un elevado número de dosis por tratamiento a pacientes picados mordidos por alacranes, arañas y serpientes principalmente. Actualmente, un uso que está cobrando gran importancia es como tratamiento para enfermedades autoinmunes como la artritis reumatoide, diabetes mellitus inmunodependiente, SIDA, anemias hemofílicas, fiebre reumática, esclerosis múltiple, tiroiditis y psoriasis, entre otras. En estos casos, se aplican los anticuerpos anticitocinas directamente al paciente ó se trata la sangre que se ha extraído del paciente re-suministrándosela posteriormente, con el propósito de eliminar las citocinas generadas por el organismo por sí mismo como respuesta a la enfermedad, mismas que de no ser removidas, finalmente pueden ocasionar los síntomas que son extremadamente molestos (ver patentes estadounidenses 5,888,511 y 4,940,670).
Existen varias clases de inmunoglobulinas denominadas IgG, IgM, IgD, IgA e IgE, del as cuales las más abundantes en la circulación sanguínea son las IgG, además son éstas las que corresponden a una respuesta inmune madura y por tanto incluyen la gran mayoría de los anticuerpos que se producen comercialmente. Todas las IgG tienen una misma estructura general (que se muestra en la figura 1) compuesta por cuatro cadenas polipeptídicas, dos pesadas (H) y dos ligeras (L) que se encuentran unidas entre sí por puentes de disulfuro. A su vez, las dos cadenas pesadas se encuentran unidas entre si por otros dos puentes de disulfuro en que se conoce como región bisagra, aproximadamente a la mitad de la longitud de las cadenas. Un poco mas cerca de la región amino terminal, cada cadena pesada se une mediante un puente de disulfuro con una cadena ligera. Cada cadena pesada tiene tres regiones constantes CH1, CH2 y CH3, las dos últimas de la región carboxilo terminal (antes de la bisagra) y la primera en la región amino terminal (inmediatamente después de la bisagra) y una región Variable (VH) en el extremo amino terminal, mientras que cada cadena ligera tiene solo una región constante, CL en el extremo carboxilo terminal y una región variable, VL en el extremo amino terminal.
Cuando las IgG son digeridas enzimáticamente, se obtienen diferentes fragmentos, dependiendo la enzima que se emplea, es decir si se utiliza papaína, se obtienen tres fragmentos, el fragmento cristalizable (Fc) y dos fragmentos de unión a antígeno (Fab) y si se emplea pepsina, se obtienen un fragmento F(ab) 2, mientras que el fragmento cristalizable es digerido. Lo anterior se debe a que la papaína corta las cadenas pesadas inmediatamente después la bisagra (hacia la región amino terminal), mientras que la pepsina lo hace antes (hacia la región carboxilo terminal) de la bisagra. Los Fab y F(ab)2 son los fragmentos que conservan la capacidad de unir específicamente el antígeno que los originó y los F(ab)2 además, lo precipitan, mientras que la fracción Fc de los anticuerpos normalmente actúa como un marcador señal para macrófagos y la activación de los linfocitos para el reconocimiento y fagocitosis de complejos antígeno-anticuerpo.
Por otro lado, el fragmento Fc comprende los determinantes antigénicos del anticuerpo, de tal forma que, al administrarle a un paciente anticuerpos completos generados en algún animal de otra especie, el paciente genera una respuesta inmune en contra de esos determinantes antigénicos dando origen a variadas respuestas secundarias adversas que incluso puede ser un choque anafiláctico.
Estos problemas se reducen significativamente al digerir previamente los anticuerpos ya sea con papaína ó pepsina y al administrar solamente los fragmentos Fab o F(ab)2 purificados resultantes.
El uso de fragmentos Fab o F(ab)2 encuentra otra ventaja en lo que se conoce como concepto de volumen de distribución, que no es sino el volumen del cuerpo en el que una determinada droga es disuelta, este volumen puede referirse solo a la sangre circulante como en el caso de las IgG ó incluir una mayor parte del agua corporal para el caso de los Fragmentos. Por ello, los Fab y F(ab)2 por tener un mayor volumen corporal pueden acceder a neutralizar toxinas alojadas en diversos tejidos, no solo en la sangre, e incluso pueden atravesar la barrera hematoencefálica en ambos sentidos y pueden ser utilizados para neutralizar o eliminar neurotoxinas.
Particularmente, el uso de los F(ab)2 tiene una ventaja sobre los Fab que consiste en que tienen un mayor tiempo de retención en el organismo pues tienen un peso molecular del doble, además de que conservan la capacidad para precipitar al antígeno en condiciones fisiológicas, y también tienen un tamaño que les permite acceder a un volumen de distribución suficiente para fines de tratamiento.
Al conservar los fragmentos F(ab)2 las principales características de los anticuerpos, las aplicaciones que tienen estos últimos se extienden a los primeros, con la ventaja adicional de que al carecer del fragmento Fc, es menos probable el reconocimiento como ajenos por parte del organismo del paciente al que se le administran, teniendo una mayor tolerancia a su aplicación y reduciéndose la posibilidad de reacciones secundarias, que resulta particularmente útil para tratamientos prolongados tales como los que se aplican en las enfermedades autoinmunes.
Desde hace ya muchos años es bien sabido que las proteínas solubles (particularmente las proteínas séricas) pierden su solubilidad conforme aumenta la concentración de sales neutras en la solución (tales como los sulfatos de amonio o de sodio). De esta manera, por ejemplo, la euglobulina precipita con sulfato de sodio al 13.5%, la pseudoglobulina con 17.4% y la pseudoglobu1ina 2 con 21.3%. Este hecho ha sido aprovechado para purificar parcialmente a los anticuerpos a partir del suero o del plasma.
En la literatura se han reportado varios enfoques de producción de anticuerpos y sus fragmentos. Por ejemplo, en la patente estadounidense 4,849,352 Sullivan et. al. reivindica la producción tanto de fragmentos Fab mediante la digestión de anticuerpos con papaína inmovilizada en poliacrilamida como la de fragmentos F(ab)2 mediante la digestión de anticuerpos con pepsina inmovilizada, obteniendo fragmentos Fab y Fc ó F(ab)2 purificando posteriormente los fragmentos por inmunoafinidad, haciéndolos pasar por una matriz de poliacrilamida que contiene al antígeno específico de los anticuerpos requeridos, recuperando después los fragmentos Fab ó F(ab)2 unidos específicamente a las moléculas en la matriz, con alguna solución fuertemente iónica. No obstante la pureza con que se obtienen los fragmentos requeridos, para una producción comercial a gran escala de preparaciones de fragmentos de anticuerpos, podrá resultar sumamente caro tanto el uso de enzimas inmovilizadas para la digestión como de antígenos inmovilizados para la purificación.
La patente US 4,806,346 se refiere al proceso...
Reivindicaciones:
1. Un método para preparar una composición de fragmentos de anticuerpos F(ab')2 que se encuentra libre de albúmina, libre de moléculas completas de anticuerpos y libre sustancias pirógenas que comprende:
2. El método de la reivindicación 1 el cual comprende el paso:
3. El método de la reivindicación 2 el cual comprende el paso
4. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde en el paso h) la pasta se somete a diálisis a una temperatura de aproximadamente 4ºC a aproximadamente 12ºC.
5. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde en el paso d) la solución obtenida en el paso c) es clarificada mediante es paso de dicha solución a través de filtros de 12 µm, 8 µm y 4 µm.
6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde los fragmentos F(ab')2 obtenidos en cualquiera de los pasos i) a k) unen y neutralizan a una molécula purificada o a una mezcla de moléculas antigénicas la cual es veneno de animales venenosos.
7. El método de la reivindicación 6, donde el veneno es veneno de arañas, alacranes, serpientes.
8. El método de la reivindicación 7, donde el veneno se deriva de un animal seleccionado del grupo que consiste de: el género de serpiente Bothrops, Crotalus, Agkistrodon, Lachesis, Sistrurus, las especies de serpientes: Micrurus nigrosinctus, la especie de serpiente viuda negra: Lactrodectus mactans, las especies de alacrán Centruroides noxius, C. limpidus, C. limpidus tecomanus, C. suffusus suffusus, o una combinación de los mismos.
9. Una composición de fragmentos F(ab')2 producidos por el método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, donde los fragmentos F(ab')2 son policlonales y capaces de neutralizar a los varios determinantes el antígeno o de una mezcla de antígenos presentes en el veneno de alacranes utilizados para obtener los anticuerpos del paso a) de la reivindicación 1, y donde la composición está libre de anticuerpos completos, libre de albúmina y libre de pirógenos.
10. La composición de la reivindicación 9, la cual contiene un acarreador farmacéuticamente aceptable.
11. La composición de las reivindicaciones 9 y 10, donde el veneno se selecciona de las especies de alacrán Centruroides noxius, C. limpidus, C. limpidus tecomanus, C. suffusus suffusus, o de una combinación de los mismos.
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