Material de soporte sólido teniendo inmovilizado covalentemente sobre el mismo un ligando de afinidad,

comprendiendo dicho ligando uno o más grupo(s) funcional(es) hidrofóbico(s) y uno o más grupo(s) funcional(es) catiónico(s),

donde al menos un grupo funcional hidrofóbico está separado de al menos un grupo funcional catiónico por una distancia a través de enlaces de entre 5 Å y 20 Å,

donde dicho ligando consiste en menos de 5 residuos y tiene un peso molecular de entre 120 Da y 1.000 Da; y

donde el ligando comprende o consiste en 3 residuos unidos covalentemente, X1-X2-X3, donde dichos residuos unidos covalentemente también están unidos covalentemente al enlazador L de la entidad L-PM, donde PM es el material de soporte sólido,

donde X1 es un aminoácido natural o no natural en una configuración D y/o L, o un residuo de ácido carboxílico comprendiendo un grupo aromático opcionalmente sustituido,

donde X2 es un aminoácido natural o no natural en una configuración D y/o L, o un residuo de ácido carboxílico comprendiendo un grupo aromático opcionalmente sustituido, con la condición de que X2 no sea un residuo de treonina, y

donde X3 es un aminoácido natural o no natural en una configuración D y/o L, o un residuo de ácido carboxílico

comprendiendo un grupo aromático opcionalmente sustituido,

donde al menos uno de X1, X2 y X3 comprende un grupo funcional catiónico, y

donde al menos uno de X1, X2 y X3 comprende un grupo funcional hidrofóbico,

donde X1 se selecciona de L-Arg, D-Lys, D-Phe, D-Pro, INA, PPC, DBHBA, 3HBA, 4HBA y SAA;

donde X2 se selecciona de L-Arg, L-Asn, D-Leu, D-Lys, D-Phe, D-Pro, L-Pro, AIB, AHX, INA, NLE y PPC; y

donde X3 se selecciona de L-Arg, L-Asn, D-Lys, D-Phe, D-Pro, L-Pro y PPC

Ligandos de afinidad de unión a anticuerpos.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a ligandos de afinidad unidos covalentemente a un material de soporte sólido, tal como una matriz de polímero, y usos de los mismos en la purificación y/o el aislamiento de biomoléculas, tales como proteínas, en particular anticuerpos, tales como anticuerpos monoclonales. Los ligandos de afinidad comprenden dos dominios diferentes o grupos funcionales: (i) un dominio hidrofóbico y (ii) un dominio catiónico.

Antecedentes de la invención

La cromatografía de afinidad habilita selectiva y reversiblemente sustancias biológicas de adsorción, tales como anticuerpos monoclonales, para una sustancia de enlace complementaria, tal como un ligando de afinidad inmovilizado en un material de soporte sólido contenido en una columna de afinidad.

Las columnas de afinidad frecuentemente contienen un material de soporte sólido, normalmente una matriz de polímero porosa, a la cual se une covalentemente un ligando adecuado directamente o mediante un enlazador. Una muestra conteniendo sustancias biológicas con una afinidad por el ligando puede ponerse en contacto con el ligando de afinidad inmovilizado covalentemente al material de soporte sólido bajo condiciones de enlace favorables que promueven un enlace específico entre el ligando y las sustancias biológicas con una afinidad por el ligando. La columna puede lavarse posteriormente con un regulador de pH para eliminar el material no enlazado, y en otra etapa las sustancias biológicas con una afinidad por el ligando pueden eluirse y obtenerse en una forma purificada o aislada. Por consiguiente, el ligando debería exhibir preferiblemente características de enlace específicas y reversibles para la sustancia biológica, tales como un anticuerpo, el cual se desee purificar o aislar.

Los anticuerpos tienen una o más copias de una unidad en forma de Y, compuesta por cuatro cadenas de polipéptidos. Cada Y contiene dos copias idénticas de una cadena "pesada", y dos copias idénticas de una "cadena ligera", llamadas así por sus pesos moleculares relativos.

Los anticuerpos pueden dividirse en cinco clases: IgG, IgM, IgA, IgD y IgE, en base al número de unidades Y y al tipo de cadena pesada. La cadena pesada determina la subclase de cada anticuerpo. Las cadenas pesadas de IgG, IgM, IgA, IgD, e IgE se conocen como gamma, mu, alfa, delta, y epsilon, respectivamente. Las cadenas ligeras de cualquier anticuerpo pueden clasificarse o bien como de tipo kappa (?) o lambda (?) (una descripción de las características moleculares del polipéptido).

Para aplicaciones farmacéuticas, el anticuerpo más frecuentemente usado es IgG el cual puede dividirse en tres partes, dos regiones F(ab) y una región Fc, por la papaina de la enzima proteolítica, o en dos partes, una región F(ab')₂ y una región Fc por la pepsina de la enzima proteolítica.

Las regiones F(ab) comprenden los "brazos" del anticuerpo, los cuales son críticos para la enlace de antígenos. La región Fc comprende la "cola" del anticuerpo y juega un papel en la respuesta inmunitaria, al igual que sirve como un "asa" útil para manipular el anticuerpo durante algunos procedimientos inmunoquímicos. El número de regiones F(ab) en el anticuerpo, se corresponde con su subclase, y determina la "valencia" del anticuerpo (dicho en términos generales, el número de "brazos" con los cuales el anticuerpo puede enlazar su antígeno).

El término "anticuerpo" significa una inmunoglobulina, producida sintéticamente o bien de forma natural o parcial o completa. Todos los fragmentos y derivados de los mismos que mantienen la capacidad de enlace específica también se incluyen en el término. Son fragmentos típicos FC, FAB, cadena pesada, y cadena ligera. El término también engloba cualquier polipéptido con un dominio de enlace homólogo o ampliamente homólogo, tal como al menos un 95% idéntico en comparación con la secuencia de aminoácidos, para un dominio de enlace de inmunoglobulina. Estos polipéptidos pueden derivarse de fuentes naturales, o producirse sintéticamente de forma parcial o completa. Un anticuerpo puede ser monoclonal o policlonal. El anticuerpo puede ser un elemento de cualquier clase de inmunoglobulina, incluyendo cualquiera de las clases humanas: IgG, IgM, IgA, IgD, e IgE. Los derivados de la clase IgG, no obstante, se prefieren en una forma de realización de la presente invención.

El término "fragmento de anticuerpo" se refiere a cualquier derivado de un anticuerpo que tenga menos que su longitud completa. Preferiblemente, el fragmento de anticuerpo retiene al menos una parte significante de la capacidad de enlace específica del anticuerpo en toda su longitud. Ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, Fab, Fab', F(ab')₂, scFv, FV, diacuerpo de dsFv, y fragmentos de Fd. El fragmento de anticuerpo puede producirse por cualquier medio. Por ejemplo, el fragmento de anticuerpo puede producirse enzimáticamente o químicamente por fragmentación de un anticuerpo intacto o puede producirse de manera recombinante a partir de un gen codificando la secuencia del anticuerpo parcial. De forma alternativa, el fragmento de anticuerpo puede producirse sintéticamente de forma completa o parcial. El fragmento de anticuerpo puede ser opcionalmente un fragmento de anticuerpo monocatenario. De forma alternativa, el fragmento puede comprender cadenas múltiples que se enlacen juntas, por ejemplo, por enlaces de disulfuro. El fragmento también puede opcionalmente ser un complejo multimolecular. Un fragmento de anticuerpo funcional típicamente comprenderá al menos aproximadamente 50 aminoácidos y más típicamente comprenderá al menos aproximadamente 200 aminoácidos.

Los "Fvs monocatenarios" (scFvs) son fragmentos de anticuerpo recombinantes que consisten sólo en la cadena ligera variable (V_L) y la cadena pesada variable (V_H) conectadas covalentemente la una a la otra por un enlazador del polipéptido. Tanto el dominio V_L como V_H pueden ser el dominio aminoterminal. El enlazador de polipéptidos puede tener una longitud y una composición variables mientras los dos dominios variables estén ligados sin interferencia estérica importante. Típicamente, los enlaces están compuestos principalmente por extensiones de glicina y residuos de serina con algún ácido glutámico o residuos de lisina intercalados para solubilidad. Los "diacuerpos" son scFvs diméricos. Los componentes de los diacuerpos típicamente tienen enlaces peptídicos más cortos que la mayoría de scFvs y muestran una preferencia para asociarse como dímeros. Un fragmento "Fv" es un fragmento de anticuerpo que consiste en un dominio V_H y un dominio V_L mantenidos juntos por interacciones no covalentes. El término "dsFv" se utiliza en este caso para referirse a un FV con un enlace de disulfuro creado genéticamente intermolecular para estabilizar el par V_H - V_L. Un fragmento "F(ab')₂" es un fragmento de anticuerpos esencialmente equivalente al obtenido a partir de inmunoglobulinas (típicamente IgG) por digestión con una pepsina enzimática a un pH 4.0-4.5. El fragmento puede producirse de forma recombinante. Un fragmento "Fab" es un fragmento de anticuerpo esencialmente equivalente al obtenido por reducción del puente o puentes de disulfuro que unen las dos partes de cadena pesada en el fragmento F(ab')₂. El fragmento Fab' puede producirse recombinantemente. Un fragmento "Fab" es un fragmento de anticuerpo esencialmente equivalente al obtenido mediante la digestión de inmunoglobulinas (típicamente IgG) con la papaína enzimática. El fragmento Fab puede producirse recombinantemente. El segmento de cadena pesada del fragmento Fab es la parte de Fd. Una región "Fc" es una región constante de una clase particular de anticuerpo.

El enlace entre antígenos y anticuerpos depende de enlaces de hidrógeno, enlaces hidrofóbicos, fuerzas electroestáticas, y fuerzas van der Waals. Estos son todos enlaces de una naturaleza débil no covalente, puesto que algunas asociaciones entre un antígeno y un anticuerpo pueden ser bastante fuertes. Por consiguiente, la constante de afinidad para la enlace antígeno-anticuerpo puede abarcar una gama amplia, extendiéndose desde menos de 10⁵ mol-¹ a más de 10¹² mol-¹. Las constantes de afinidad están afectadas por la temperatura, el pH y el solvente. Además de una afinidad de un anticuerpo por un ligando, la estabilidad global de un complejo de ligando-anticuerpo también se determina por la valencia del antígeno...

1. Material de soporte sólido teniendo inmovilizado covalentemente sobre el mismo un ligando de afinidad, comprendiendo dicho ligando uno o más grupo(s) funcional(es) hidrofóbico(s) y uno o más grupo(s) funcional(es) catiónico(s),

donde al menos un grupo funcional hidrofóbico está separado de al menos un grupo funcional catiónico por una distancia a través de enlaces de entre 5 Å y 20 Å,

donde dicho ligando consiste en menos de 5 residuos y tiene un peso molecular de entre 120 Da y 1.000 Da; y

donde el ligando comprende o consiste en 3 residuos unidos covalentemente, X₁-X₂-X₃, donde dichos residuos unidos covalentemente también están unidos covalentemente al enlazador L de la entidad L-PM, donde PM es el material de soporte sólido,

donde X₁ es un aminoácido natural o no natural en una configuración D y/o L, o un residuo de ácido carboxílico comprendiendo un grupo aromático opcionalmente sustituido,

donde X₂ es un aminoácido natural o no natural en una configuración D y/o L, o un residuo de ácido carboxílico comprendiendo un grupo aromático opcionalmente sustituido, con la condición de que X₂ no sea un residuo de treonina, y

donde X₃ es un aminoácido natural o no natural en una configuración D y/o L, o un residuo de ácido carboxílico

comprendiendo un grupo aromático opcionalmente sustituido,

donde al menos uno de X₁, X₂ y X₃ comprende un grupo funcional catiónico, y

donde al menos uno de X₁, X₂ y X₃ comprende un grupo funcional hidrofóbico,

donde X₁ se selecciona de L-Arg, D-Lys, D-Phe, D-Pro, INA, PPC, DBHBA, 3HBA, 4HBA y SAA;

donde X₂ se selecciona de L-Arg, L-Asn, D-Leu, D-Lys, D-Phe, D-Pro, L-Pro, AIB, AHX, INA, NLE y PPC; y

donde X₃ se selecciona de L-Arg, L-Asn, D-Lys, D-Phe, D-Pro, L-Pro y PPC.

2. Material de soporte sólido teniendo inmovilizado covalentemente sobre el mismo un ligando de afinidad, comprendiendo dicho ligando uno o más grupo(s) funcional(es) hidrofóbico(s) y uno o más grupo(s) funcional(es) catiónico(s),

donde al menos un grupo funcional hidrofóbico se separa de al menos un grupo funcional catiónico por una distancia a través de enlaces de entre 5 Å y 20 Å,

donde dicho ligando consiste en menos de 5 residuos y tiene un peso molecular de entre 120 Da y 1.000 Da; y

donde el ligando de afinidad comprende o consiste en los residuos unidos covalentemente X₁-X₂-X₃, donde opcionalmente X₁, X₂ y/o X₃, se enlaza con un residuo de enlazador, L; y

donde

el residuo X₁ se selecciona del grupo que consiste en Arg, Phe, PPC, DBHBA, SAA, DAP, DAB, (DBHBA)₂-DAP, (MDCA)₂-DAP, DPBBA, DBBA, PCAA, DPPAA, Trp, TMPPA, y DBHPA,

el residuo X₂ se selecciona del grupo que consiste en Arg, Asn, Leu, Lys, Phe, Pro, PPC, DAP, DAB, His, Trp, Tyr, y Ser, y

el residuo X₃ se selecciona del grupo que consiste en Arg, Asn, Pro, PPC, Asp, Orn, y (1H2NA)Dap.

3. Material de soporte sólido que tiene inmovilizado covalentemente sobre el mismo un ligando de afinidad, comprendiendo dicho ligando uno o más grupo(s) funcional(es) hidrofóbico(s) y uno o más grupo(s) funcional(es) catiónico(s),

donde al menos un grupo funcional hidrofóbico se separa de al menos un grupo funcional catiónico por una distancia a través de enlaces de entre 5 Å y 20 Å,

donde dicho ligando consiste en 3 residuos seleccionados del grupo que consiste en D-Leu; D-Lys; D-Phe; D-Pro; L-Arg; L-Asn; L-Pro; Ahx; Aib; DBHBA; INA; Nle; PPC; SAA; 3HBA y 4HBA, y tiene un peso molecular de entre 120 Da y 1.000 Da.

4. Material de soporte sólido según cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2 y 3, donde dicha resina de afinidad tiene una capacidad de enlace mayor que 5 mg de anticuerpo monoclonal por ml de resina de afinidad.

5. Material de soporte sólido según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el ligando comprende o consiste en uno o más de:

D-Phe-(L)Arg-(L)Arg,

L-Arg-D-Phe-(L)Arg,

PPC-D-Pro-(L)Arg,

PPC-D-Leu-PPC,

INA-D-Phe-PPC,

PPC-AIB-PPC,

L-Arg-(L)Arg-D-Phe,

PPC-(L)Arg-D-Pro,

D-Pro-PPC-(L)Arg,

L-Arg-D-Pro-PPC,

D-Lys-INA-(L)Arg,

INA-(L)Arg-D-Lys,

PPC-AHX-PPC,

PPC-Nle-PPC,

SAA-(L)Arg-(L)Pro,

SAA-(L)Pro-(L)Arg,

DBHBA-(L)Arg-(L)Asn,

DBHBA-(L)Asn-(L)Arg,

3HBA-(L)Arg-(L)Pro,

3HBA-(L)Pro-(L)Arg,

4HBA-(L)Arg-(L)Pro, y

4HBA-(L)Pro-(L)Arg,

6. Material de soporte sólido según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde el ligando es uno seleccionado del grupo que consiste en

H₂N-(D)Phe-(L)Arg-(L)Arg-Gly-OH,

H₂N-(L)Arg-(D)Phe-(L)Arg-Gly-OH,

HN-PPC-(D)Pro-(L)Arg-Gly-OH,

DBBA-(L)His-(L)Arg-Gly-OH,

DBBA-His-Arg-Gly-OH,

DBBA-His-Arg-Arg-Gly-OH,

DPPBA-(L)Phe-(L)Arg-Gly-OH,

PCAA-(L)Phe-(L)Arg-Gly-OH,

DPPBA-(L)Lys-(L)Arg-Gly-OH,

SAA-(L)Arg-(L)Pro-Gly-OH,

SAA-(L)Pro-(L)Arg-Gly-OH,

DBHBA-(L)Arg-(L)Asn-Gly-OH,

DBHBA-(L)Asn-(L)Arg-Gly-OH,

DPPBA-(L)Trp-(L)Arg-Gly-OH,

(MDCA)₂ DAP-(L)Arg-(L)Orn-Gly-OH,

(MDCA)₂ DAP-(L)Arg-(L)Asp-Gly-OH,

DPPAA-(L)Phe-(L)Arg-Gly-OH,

DPPAA-PPC-(L)Arg-Gly-OH,

DBHBA-(D)Phe-(D)Arg-Gly-OH,

DPPAA-(D)Tyr-(D)Arg-Gly-OH,

(DPPA)₂ DAP-(L)Arg-(L)Orn-Gly-OH,

(DBHBA)₂ DAP-(L)Arg-(L)Arg-Gly-OH,

DBHBA-DAP-Arg-Gly-OH,

DBHBA-DAP-Arg-Arg-Gly-OH,

(DBHBA)₂ DAP-Arg-Gly-OH,

(DBHBA)₂ DAP-Arg-Arg-Gly-OH,

TMPPA-(L)Trp-(L)Arg-Gly-OH, y

DBHPA-(L)Arg-(L)Orn-Gly-OH.

7. Material de soporte sólido según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde el ligando es uno seleccionado del grupo que consiste en

D-Phe-(L)Arg-(L)Arg-Gly,

L-Arg-D-Phe-(L)Arg-Gly,

PPC-D-Pro-(L)Arg-Gly,

PPC-D-Leu-PPC-Gly,

INA-D-Phe-PPC-Gly,

PPC-AIB-PPC-Gly,

L-Arg-(L)Arg-D-Phe-Gly,

PPC-(L)Arg-D-Pro-Gly,

D-Pro-PPC-(L)Arg-Gly,

L-Arg-D-Pro-PPC-Gly,

D-Lys-INA-(L)Arg-Gly,

INA-(L)Arg-D-Lys-Gly,

PPC-AHX-PPC-Gly,

PPC-Nle-PPC-Gly,

SAA-(L)Arg-(L)Pro-Gly,

SAA-(L)Pro-(L)Arg-Gly,

DBHBA-(L)Arg-(L)Asn-Gly,

DBHBA-(L)Asn-(L)Arg-Gly,

3HBA-(L)Arg-(L)Pro-Gly,

3HBA-(L)Pro-(L)Arg-Gly,

4HBA-(L)Arg-(L)Pro-Gly, y

4HBA-(L)Pro-(L)Arg-Gly.

8. Material de soporte sólido según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el ligando se selecciona del grupo que consiste en DBBA-(L)His-(L)Arg-Gly-OH y (DBHBA)₂-DAP-(L)Arg-(L)Arg-Gly-OH.

9. Método para el aislamiento de anticuerpos o derivados de los mismos, incluyendo el método las etapas de (i) proporcionar un material de soporte sólido teniendo inmovilizado covalentemente sobre el mismo un ligando de afinidad tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1-8, (ii) proporcionar una muestra conteniendo un anticuerpo con una afinidad por dicho ligando, (iii) poner en contacto dicho ligando con dicha muestra conteniendo dicho anticuerpo, (iv) enlazar selectivamente dicho anticuerpo cuando dicho anticuerpo está contenido en dicha muestra y (v) aislar selectivamente dicho anticuerpo cuando dicho anticuerpo está contenido en dicha muestra.