Procedimiento de obtención de melaninas y sus aplicaciones.

La presente invención se refiere a un procedimiento de obtención y posterior cuantificación de pigmentos de melaninas,

caracterizado porque comprende las etapas de: tratamiento inicial alcalino, separación de las feomelaninas, obtención del concentrado seco de eumelanina mediante lavado del precipitado y posterior centrifugación, solubilización del concentrado seco de eumelanina mediante oxidación alcalina controlada en el tiempo, y neutralización de las soluciones para obtener concentrados secos de feomelanina y pseudofeomelanina. Específicamente, se describe la obtención de concentrados secos de feomelanina, eumelanina y pseudofeomelanina naturales a partir de plumas de ave o de pelos coloreados de mamífero, y su uso como materia prima para fines industriales en cosmética (cremas, maquillajes y tintes) y dermatología (para tratamiento de enfermedades que cursan con despigmentación)

Procedimiento de obtención de melaninas y sus aplicaciones.

Sector de la técnica

La presente invención se engloba dentro del sector de la química. Concretamente describe la obtención y posterior cuantificación de melaninas purificadas por medio de una técnica de bajo coste. Específicamente describe la obtención de concentrados secos de feomelanina, eumelanina y pseudofeomelanina naturales a partir de plumas de ave o de pelos coloreados de mamífero, que pueden ser empleados como materia prima para fines industriales en cosmética (cremas, maquillajes y tintes) y dermatología (para tratamiento de enfermedades que cursan con despigmentación).

Estado de la técnica

Melanina es un término general que describe una familia de pigmentos quinol-fenólicos de diverso origen y naturaleza química. Dependiendo de su procedencia biológica, las melaninas se dividen en tres grupos: microbiales, animales y vegetales. Existen también melaninas sintéticas. Las melaninas animales son los pigmentos más comunes en el tegumento de los vertebrados (McGraw 2006), incluyendo la piel de los humanos (Jablonski 2006). Desde el punto de vista químico, existen dos tipos básicos de melaninas: feomelaninas y eumelaninas, que dan lugar a la enorme paleta de colores melánicos observada de acuerdo a su concentración, proporciones relativas y contraste con zonas despigmentadas. Las feomelaninas contienen azufre y se perciben como coloraciones rojizas o rubias, tanto en el pelo o la piel de los mamíferos como en las plumas de las aves. Las eumelaninas son negras o pardas, y ese es el color que confieren a las estructuras tegumentarias.

A diferencia de los carotenoides, pigmentos exclusivamente vegetales que deben ser ingeridos en la dieta, y que son responsables de los colores más brillantes de las aves, incluyendo amarillos y rojos, las melaninas son sintetizadas por el propio organismo a partir de precursores aminoácidos. También difieren en que mientras las melaninas pueden aparecer dentro de una misma pluma como bandas o puntos alternados con zonas despigmentadas o con diferente grado de mecanización, los carotenoides ocupan regiones continuas de color. Esta característica permite infinitas variantes, y así, por ejemplo, las aves de presa diurnas (Orden Falconiformes, con unas 300 especies), presentan plumajes distintivos y específicos exclusivamente melánicos y aún numerosas especies entre ellas presentan gran variación individual. Entre las palomas asilvestradas (Columba livia) se han descrito más tipos básicos de coloración que en ninguna especie de ave silvestre, y esa multiplicidad fenotípica de nuevo responde a múltiples combinaciones de tonos melánicos.

En cuanto a la función de las melaninas en el tegumento, se presupone esencialmente fotoprotectora, ya que evita los daños que causa la radiación ultravioleta (W) del sol. Tienen, no obstante, otras funciones potenciales: debido a su estructura pueden proteger células y tejidos del estrés oxidativo atrapando radicales libres (McGraw 2006) y, en el caso de las plumas de las aves, se ha sugerido que las plumas melanizadas son más resistentes al deterioro por abrasión o rotura mecánica (Burtt 1986), y quizá también al ataque de bacterias (Burtt e Ichida 1999) aunque este último aspecto ha sido puesto en entredicho recientemente (Grande y Cols 2004).

A pesar de la enorme prevalencia de las melaninas en el tegumento de los vertebrados, y del enorme interés suscitado por el análisis del color en el marco de los estudios evolutivos y del comportamiento (e.g., Hill y McGraw 2006), no existen procedimientos analíticos sencillos para identificarlas y cuantificarlas. Las melaninas presentan una estructura compleja y ha sido históricamente muy difícil analizarlas bioquímicamente (Ito 2000). En la actualidad para extraerlas se utilizan métodos químicos (Ito y Fujita 1985) o enzimáticos (Liu et al. 2003). Los métodos químicos, que se basan en extracciones ácido/base y fragmentaciones oxidativas y están considerados como muy agresivos porque alteran la estructura molecular de la melanina, dan lugar a metabolitos incoloros que son posteriormente separados mediante cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) y cuantificados por detección UV-visible y detector electroquímico (Liu et al. 2003). Los métodos químicos de extracción de melaninas se pueden dividir en dos grandes grupos: el primer grupo consiste en la extracción de melaninas con disolventes adecuados, fundamentalmente álcalis, y posterior eliminación de la mezcla acompañante. El segundo grupo de métodos consiste en extraer todas las demás materias, a excepción de la melanina, mediante hidrólisis ácida y lavado con un disolvente adecuado hasta obtener la melanina. Por otra parte, los métodos enzimáticos de extracción están basados en el uso de proteasas que degradan las queratinas que envuelven a las melaninas en el pelo o en las plumas (Liu 2003).

Por lo que respecta a los plumajes de las aves, se ha descrito que en toda pluma melanizada co-existen feo- y eumelanina en diferentes proporciones. Para la determinación y cuantificación de ambos tipos de melaninas en plumas, en la actualidad se siguen utilizando los procedimientos de Ito y Fujita (1985) con algunas modificaciones posteriores (Ito y Wakamatsu 1994, Wakamatsu e Ito 2002). Sus métodos se basan en el análisis mediante HPLC de los productos de degradación de la eumelanina tras ser oxidada y de la feomelanina tras ser hidrolizada. Para calcular su concentración es preciso utilizar, no obstante, factores de corrección, puesto que la conversión en productos de degradación es incompleta.

Debido a que los métodos de laboratorio son relativamente complejos, hasta muy recientemente sólo se ha determinado la proporción y concentración de eumelaninas y feomelaninas en el plumaje de 13 especies de aves (McGraw 2006). Esto contrasta con la identificación y cuantificación de carotenoides en 150 especies de aves, e indica que los estudios de melanización en aves están en su infancia. Un método simplificado con resultados repetibles es necesario y ese ha sido el objetivo de la presente invención. Basándose en el hecho de que la feomelanina es fácilmente solubilizable en medio alcalino pero la eumelanina es insoluble tanto en medio ácido como alcalino, el procedimiento presentado en esta invención describe, por primera vez, un método para la obtención de la fracción feomelánica por un lado y de la fracción eumelánica por otro, partiendo de una digestión alcalina a partir de pluma de ave o de pelo coloreado de mamífero. Además, la posibilidad de solubilizar el concentrado insoluble de eumelanina en forma de pseudofeomelanina en medio alcalino, permite cuantificar espectrofotometricamente la concentración relativa de feomelanina y eumelanina sin necesidad de recurrir al HPLC. Por otro lado, este método permite obtener concentrados secos de las tres fracciones, feomelaninas, eumelaninas y pseudosfeomelaninas, que pueden ser empleados como materia prima natural para su uso en cosmética o dermatología.

Descripción de la invención

En la presente invención se describe, por primera vez, un procedimiento para la obtención, a partir de una materia prima de nula utilidad como es la pluma de ave o ciertos pelos coloreados de mamífero, de extractos purificados de feomelanina, eumelanina y pseudofeomelanina. Dicho procedimiento es sencillo y poco costoso, y permite la utilización de los extractos obtenidos tanto para cremas fotoprotectoras, como para maquillaje con fines cosméticos o fines dermatológicos en enfermedades que cursan con despigmentación de la piel. Además, la presente invención presenta un procedimiento simple y fiable de cuantificación de melaninas.

Por tanto, un aspecto de la presente invención lo constituye un procedimiento de separación, cuantificación y obtención de concentrados sólidos de feomelanina, eumelanina y pseudoeumelanina basado en la solubilidad conocida de las feomelaninas en medio alcalino y que comprende las siguientes etapas:

1. Procedimiento de obtención de pigmentos de melaninas caracterizado porque comprende las siguientes etapas:

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque el tratamiento inicial alcalino de a) se realiza con NaOH preferentemente al 20t en agua, en un baño con sonicación, preferentemente a 60ºC, durante al menos 20 minutos, y preferentemente durante 40 minutos con agitación periódica de la muestra.

3. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque la separación de las feomelaninas de b) se realiza mediante centrifugación, preferentemente durante 15 minutos a 17500 g y 4ºC, retirándose el sobrenadante que contiene la fracción de feomelaninas solubilizadas.

4. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque el lavado para la obtención de eumelaninas en estado sólido de c) se realiza preferentemente mediante resuspensión en NaOH al 20ó y posterior centrifugación a 17500 g durante 15 minutos repitiendo la operación tres veces.

5. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque la oxidación alcalina de la fracción eumelánica precipitada de d) se realiza preferentemente mediante adición de H₂O₂ al 30% en agua al precipitado eumelánico resuspendido en NaOH al 20%, sonicación a 60ºC durante 10 minutos de la muestra, y detención de la reacción mediante adición de un antioxidante, preferentemente HNaSO₃ al 40% en agua.

6. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque la obtención de los concentrados sólidos de feomelanina y pseudofeomelanina de e) se realiza mediante un proceso de neutralización de las soluciones, preferentemente con HCl al 20% seguido de HCl 0.1 N, y posterior centrifugación.

7. Procedimiento según las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque la materia prima utilizada consiste en plumas de ave o pelos coloreados de mamífero.

8. Procedimiento de cuantificación de melaninas caracterizado porque comprende la obtención de melaninas según las reivindicaciones 1 a 7 y su medida espectrofotométrica, preferentemente mediante medida de absorbancia a 450 nm restándole la obtenida a 600 nm frente a un blanco de solución acuosa de NaOH al 20%, y dividido por el peso de muestra original para expresar la concentración de eumelaninas, en forma de pseudofeomelaninas, y de feomelaninas como UA/g de materia prima.

9. Uso de las melaninas obtenidas según las reivindicaciones 1 a 7 para la preparación de composiciones cosméticas.

10. Uso de las melaninas según la reivindicación 9 en dónde la composición cosmética comprende alguno de los siguientes productos: maquillaje de piel, pestañas, cejas, labios o uñas, tintes para cabellos o para vello, tintes para tatuajes, o cualquier otro producto de uso cosmético.

11. Uso de las melaninas obtenidas según las reivindicaciones 1 a 7 para la preparación de protectores solares frente a la radiación UV.

12. Uso de las melaninas obtenidas según las reivindicaciones 1 a 7 para la preparación de composiciones con fines dermatológicos en enfermedades que cursen con despigmentación de la piel.