METODO DE PRODUCCION DE UNA PREPARACION CATIONICA DE LIPOSOMAS QUE COMPRENDE UN COMPUESTO LIPOFILO.

Un método para producir una preparación catiónica de liposomas que comprende al menos un compuesto anfifílico seleccionado de lípidos catiónicos en una cantidad de al menos aproximadamente 30% molar,

opcionalmente al menos un compuesto anfifílico adicional en una cantidad de hasta aproximadamente 69,9% molar, un compuesto lipófilo activo en una cantidad de al menos aproximadamente 0,1% molar y un agente estabilizador en una cantidad de aproximadamente 0,1% (m/v) hasta aproximadamente 20% (m/v), que comprende los pasos de

a) proporcionar

i. una solución orgánica que comprende un disolvente orgánico, dicho compuesto activo y dicho lípido catiónico, y opcionalmente dicho compuesto anfifílico adicional,

ii. una solución acuosa que comprende dicho agente estabilizador,

b) preparar una preparación catiónica de liposomas a partir de dicha solución a) i. y a) ii., en donde dicha preparación comprende liposomas catiónicos en un medio acuoso,

c) opcionalmente, homogeneizar dicha preparación al menos una vez y/o

d) opcionalmente, filtrar dicha preparación en condiciones estériles,

e) deshidratar dicha preparación y

f) opcionalmente, reconstituir dichos liposomas catiónicos del paso e) en una solución acuosa y en donde opcionalmente antes del paso c) y/o d) se incluye un paso de ultrafiltración

Método de producción de una preparación catiónica de liposomas que comprende un compuesto lipófilo.

La presente invención se refiere a un método para producir una preparación catiónica de liposomas que contiene un compuesto lipófilo activo, v.g. un taxano, que tiene estabilidad alta y que es adecuado para aplicaciones terapéuticas.

Los liposomas son pequeñas vesículas esféricas compuestas fundamentalmente de diversos tipos de lípidos, fosfolípidos y otros componentes lipófilos. Los componentes lipídicos forman normalmente una bicapa, donde el extremo polar del compuesto anfifílico está en contacto con la solución circundante, que es típicamente una solución acuosa. El extremo no polar hidrófobo del compuesto anfifílico está en contacto con otro extremo no polar hidrófobo de otro compuesto anfifílico formando de este modo la bicapa lipídica. Dependiendo del tipo de compuestos anfifílicos utilizados, la membrana liposómica puede clasificarse de acuerdo con su carga externa en membranas neutras netas, y membranas cargadas negativa y positivamente.

Se han desarrollado liposomas para muchas aplicaciones terapéuticas y diagnósticas. Entre otras aplicaciones, se utilizan para suministrar moléculas que no son suficientemente solubles en agua. Estas moléculas lipófilas se incorporan en la bicapa del liposoma o están unidas químicamente a la bicapa lipídica.

El paclitaxel, el representante más importante de la familia de los taxanos, es un compuesto altamente lipófilo de este tipo. El paclitaxel se conoce como Taxol que es el fármaco formulado en aceite de ricino polietoxilado (Cremophor® EL) y etanol absoluto. Adicionalmente, el paclitaxel ha sido formulado en liposomas.

Antes de aplicar Taxol® a los humanos, el vehículo farmacéutico con el compuesto terapéutico se diluye en una solución acuosa adecuada. Sin embargo, se ha observado que el vehículo causa reacciones anafilácticas graves, que ponen en riesgo la vida en animales y humanos, y es físicamente incompatible con algunos sistemas de infusión intravenosa. Por esta razón, se han realizado varios intentos a fin de eliminar el Cremophor® EL por reformulación del fármaco en un vehículo mejor tolerado. Los liposomas se han caracterizado clínicamente durante las últimas décadas y se ha comprobado que son un sistema de suministro de fármacos seguro y bien tolerado. Los liposomas pueden estar constituidos por lípidos existentes naturalmente que llevan un grupo principal polar que es neutro o está cargado negativamente. Los lípidos de diacilglicéridos cargados positivamente no existen en la naturaleza.

Sharma et al. [1] fabricaron liposomas neutros de paclitaxel de acuerdo con el denominado método de película. Los lípidos, fosfatidilcolina (PC) y fosfatidilglicerol (PG) se disolvían junto con paclitaxel en cloroformo. El cloroformo se evaporaba a 40ºC y la película paclitaxellípido se disolvía en terc-butanol. La solución se dividía en partes alícuotas y se liofilizaba. El polvo se hidrataba con tampón (NaCl/Tes/EDTA: 140 mM/10 mM/0,1 mM) dando una suspensión bruta de liposomas, que se procesaba ulteriormente en un baño de ultrasonidos a 20ºC. Se ha demostrado la estabilidad química del fármaco en estas formulaciones durante más de dos meses a 4ºC y a la temperatura ambiente. El pH se especifica dentro del intervalo fisiológico de pH 7-7,5.

En la Patente EE.UU. 6.090.955 Rezska et al. describieron la fabricación de liposomas neutros de paclitaxel a partir de fosfatidilcolina de huevo de acuerdo con el método de película. La suspensión bruta de liposomas, pH 7,2-7,4, constituida por vesículas de capas múltiples (MLV) se homogeneizaba con un homogeneizador de alta presión. Para almacenamiento a más largo plazo, se sugiere la formación de gel o liofilización. Sin embargo, no se presentó dato alguno acerca de la estabilidad, v.g. no se abordó la estabilidad química del paclitaxel.

Recientemente se ha comunicado que los liposomas catiónicos representan no sólo otra variedad de un sistema con vehículo liposómico sino que exhiben también un efecto específico de direccionamiento a áreas neoangiogénicas en los vasos sanguíneos [2]. Se han utilizado frecuentemente liposomas catiónicos para el suministro de genes, pero se sabe poco acerca de sus características de formulación para otros compuestos en comparación con los liposomas neutros o aniónicos.

Campbell et al. [3] formularon liposomas de paclitaxel con contenido variable de lípido catiónico, encontrando una estabilidad física incrementada de los liposomas que contenían paclitaxel. Los liposomas se fabricaron de acuerdo con el método de película. La película se hidrató con agua, que se calentaba a una temperatura de 5-10ºC por encima de la temperatura de transición de fase del fosfolípido respectivo que se utilizaba. La suspensión de liposomas se trató luego por ultrasonidos en un aparato de ultrasonidos de tipo baño. El diámetro de los liposomas resultantes estaba comprendido en el intervalo de 500-800 nm. Se indicó que la estabilidad física de estos liposomas alcanzaba un máximo de tres días. Las condiciones como temperatura y pH en las que se mantenían estos liposomas no se describieron. Sin embargo, una estabilidad de unos pocos días no es suficiente para una formulación farmacéutica si se aplica para propósitos clínicos.

Otra clase de moléculas altamente lipófilas son las epotilonas, específicamente las epotilonas A y B. Para ambos compuestos, se ha descrito la falta de estabilidad a pH bajo y se atribuye a reacciones de apertura de anillo del resto epóxido catalizadas por ácidos. Esto conduce a productos de reacción que habían perdido sus excepcionales propiedades citotóxicas [9]. La aparente inestabilidad de las epotilonas A y B no permite el desarrollo de formulaciones orales de epotilona A o B, dado que el pH del estómago es aproximadamente 1-3 y degradaría rápidamente la epotilona citostática A o B [10].

Se ha publicado que la semivida en plasma, especialmente de la epotilona B es extremadamente baja debido a su degradación metabólica por las esterasas [11, 12]. Esto es cierto también para otras epotilonas; en el plasma de murino, se encontró que la semivida aproximada in vitro de la desoxi-epotilona B (epotilona D) es 20 min, y en el plasma humano la semivida era aproximadamente 3 h [13]. Esto no permite una exposición continua de alto nivel del tumor al fármaco y la insatisfactoria actividad antitumoral in vivo de las epotilonas A y B se ha atribuido a su deficiente estabilidad metabólica [12].

Se han descrito composiciones liposómicas de las epotilonas A o B. [WO 01/10412 A1]. En este caso, se hace referencia a la inestabilidad general de estas epotilonas, y se considera esto como una base racional para la carga de liposomas. Sin embargo, no se presenta dato alguno para respaldar que la estabilidad de las epotilonas liposómicas es mayor que la de las epotilonas no liposómicas.

La mayoría de los pasos de preparación para la fabricación de liposomas se realizan en un ambiente acuoso (formación de las vesículas, homogeneización y/o eliminación de componentes indeseables, reconstitución de las formulaciones liofilizadas). Durante estos pasos, los componentes liposómicos así como los ingredientes activos que se cargan en la membrana del liposoma son propensos a la degradación.

La estabilidad fisicoquímica de los liposomas que contienen fármacos es un factor limitante para el desarrollo de un producto farmacéutico con una vida útil suficiente para almacenamiento, distribución y aplicación a humanos después de su fabricación.

Un enfoque para aumentar la estabilidad fisicoquímica de los liposomas cargados con fármaco consiste en eliminar cuantitativamente el agua de la suspensión de liposomas. Métodos que se han aplicado con éxito para eliminar el agua de los liposomas son liofilización, secado por pulverización o evaporación. Típicamente, una suspensión de liposomas se fabrica dispersando los compuestos anfifílicos en un entorno acuoso. Inmediatamente después de la fabricación del material acuoso a granel, se deshidrata la suspensión por cualquier método adecuado y se guarda hasta su aplicación en estado desecado. Durante el proceso de secado puede utilizarse un agente estabilizador para mantener la estructura del liposoma. El agua que está asociada usualmente con la superficie polar del liposoma se reemplaza por el agente estabilizador durante el secado para mantener las características fisicoquímicas del liposoma. El fármaco se mantiene cargado...

1. Un método para producir una preparación catiónica de liposomas que comprende al menos un compuesto anfifílico seleccionado de lípidos catiónicos en una cantidad de al menos aproximadamente 30% molar, opcionalmente al menos un compuesto anfifílico adicional en una cantidad de hasta aproximadamente 69,9% molar, un compuesto lipófilo activo en una cantidad de al menos aproximadamente 0,1% molar y un agente estabilizador en una cantidad de aproximadamente 0,1% (m/v) hasta aproximadamente 20% (m/v),

que comprende los pasos de

        a)        proporcionar

i.        una solución orgánica que comprende un disolvente orgánico, dicho compuesto activo y dicho lípido catiónico, y opcionalmente dicho compuesto anfifílico adicional,

ii.        una solución acuosa que comprende dicho agente estabilizador,

        b)        preparar una preparación catiónica de liposomas a partir de dicha solución a) i. y a) ii., en donde dicha preparación comprende liposomas catiónicos en un medio acuoso,

        c)        opcionalmente, homogeneizar dicha preparación al menos una vez y/o

        d)        opcionalmente, filtrar dicha preparación en condiciones estériles,

        e)        deshidratar dicha preparación y

        f)        opcionalmente, reconstituir dichos liposomas catiónicos del paso e) en una solución acuosa y

en donde opcionalmente antes del paso c) y/o d) se incluye un paso de ultrafiltración.

2. El método de la reivindicación 1, en donde dicha preparación de liposomas que comprende dicho compuesto activo es física y químicamente estable en uno cualquiera de los pasos b) a d) o f) durante al menos 12 horas a aproximadamente 2 hasta aproximadamente 8º o al menos aproximadamente 4 horas a la temperatura ambiente.

3. El método de la reivindicación 1 ó 2, en donde el valor de pH del medio acuoso en uno cualquiera de los pasos b) a d) o f) está comprendido entre aproximadamente 3 y 7, con preferencia entre aproximadamente 4 y aproximadamente 6,5.

4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la solución acuosa del paso a) ii) comprende ácido cítrico.

5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde al menos uno de los pasos b) a d) y f) se realiza a una temperatura entre aproximadamente -1ºC y aproximadamente 15ºC, con preferencia entre aproximadamente 1ºC y aproximadamente 10ºC y de modo más preferido entre aproximadamente 2ºC y aproximadamente 8ºC.

6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el paso b) se realiza por un procedimiento de película lipídica o inyección de disolvente.

7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde dicha compuesto anfifílico adicional es no catiónica y se selecciona preferiblemente de esteroles tales como colesterol, fosfolípidos, lisolípidos, lisofosfolípidos, esfingolípidos o lípidos pegilados y combinaciones de los mismos.

8. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde dicha compuesto anfifílico es di-acilfosfatidilcolina.

9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde dicho compuesto activo lipófilo se selecciona de un taxano, una camptotecina, una epotilona, una estatina, un depsipéptido, talidomida, otros agentes que interaccionan con los microtúbulos tales como discodermolida, laulimalida, isolaulimalida, eleuterobín, Sarcodictina Ay B.

10. Un método para producir una preparación catiónica de liposomas que comprende al menos una compuesto anfifílico seleccionada de lípidos catiónicos en una cantidad de al menos aproximadamente 30% molar, opcionalmente al menos una compuesto anfifílico adicional en una cantidad de hasta aproximadamente 68% molar, un taxano en una cantidad de al menos aproximadamente 2% molar, y un agente estabilizador en una cantidad de aproximadamente 0,1% (m/v) a aproximadamente 20% (m/v),

que comprende los pasos de:

        a)        proporcionar

i.        una solución orgánica que comprende un disolvente orgánico, dicho taxano y dicho lípido catiónico, y opcionalmente dicho compuesto anfifílico adicional,

ii.        una solución acuosa que comprende dicho agente estabilizador,

        b)        preparar una preparación catiónica de liposomas a partir de dicha solución a) i. y a) ii., en donde dicha preparación comprende liposomas catiónicos en un medio acuoso,

        c)        opcionalmente, homogeneizar dicha preparación al menos una vez y/o

        d)        opcionalmente, filtrar dicha preparación en condiciones estériles,

        e)        deshidratar dicha preparación y

        f)        opcionalmente, reconstituir dichos liposomas catiónicos del paso e) en una solución acuosa y

en donde opcionalmente antes del paso c) y/o d) se incluye un paso de ultrafiltración.

11. El método de la reivindicación 10, en donde dicha preparación de liposomas que comprende dicho taxano es física y químicamente estable en uno cualquiera de los pasos b) a d) o f) durante al menos 12 horas a aproximadamente 2 hasta aproximadamente 8ºC y al menos aproximadamente 4 horas a la temperatura ambiente.

12. El método de la reivindicación 10 ó 11, en donde la solución acuosa del paso a) ii) comprende ácido cítrico.

13. El método de la reivindicación 10 a 12, en donde dicho taxano se selecciona de paclitaxel o docetaxel o cualquier derivado lipófilo de los mismos.

14. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, en donde dicha preparación de liposomas comprende paclitaxel en una cantidad de aproximadamente 5% molar.

15. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, en donde dicha preparación de liposomas comprende docetaxel en una cantidad de al menos aproximadamente 5% molar.

16. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, en donde dicha preparación de liposomas comprende succinil-paclitaxel en una cantidad de al menos aproximadamente 5% molar.

17. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en donde dicha preparación de liposomas comprende liposomas con un tamaño medio de partícula de aproximadamente 50 nm a aproximadamente 400 nm, con preferencia aproximadamente 100 nm a aproximadamente 300 nm.

18. Una preparación catiónica de liposomas que puede obtenerse por un proceso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17.

19. Una forma deshidratada de un preparación catiónica de liposomas, que comprende al menos un lípido catiónico de al menos aproximadamente 30% molar, opcionalmente al menos una compuesto anfifílico adicional de hasta aproximadamente 69,9% molar, un compuesto lipófilo activo de al menos aproximadamente 2% molar y un agente estabilizador de aproximadamente 0,1% (m/v) a aproximadamente 20% (m/v), caracterizada porque dicha preparación de liposomas es física y químicamente estable en una solución acuosa durante al menos 12 horas a 2 hasta 8ºC y al menos 4 horas a la temperatura ambiente.

20. Una forma deshidratada de una preparación catiónica de liposomas que comprende al menos un lípido catiónico de al menos aproximadamente 30% molar, opcionalmente al menos una compuesto anfifílico adicional de hasta aproximadamente 65% molar, paclitaxel de aproximadamente 5% molar y un agente estabilizador de aproximadamente 0,1% (m/v) a aproximadamente 20% (m/v), caracterizada porque dicha preparación de liposomas es física y químicamente estable en una solución acuosa durante al menos 12 horas a 2 hasta 8ºC y al menos 4 horas a la temperatura ambiente.

21. Una forma deshidratada de una preparación catiónica de liposomas que comprende al menos un lípido catiónico de al menos aproximadamente 30% molar, opcionalmente al menos una compuesto anfifílico adicional de hasta aproximadamente 65% molar, docetaxel de al menos aproximadamente 5% molar y un agente estabilizador de aproximadamente 0,1% (m/v) a aproximadamente 20% (m/v).

22. Una forma deshidratada de una preparación catiónica de liposomas que comprende al menos un lípido catiónico de al menos aproximadamente 30% molar, opcionalmente al menos una compuesto anfifílico adicional de hasta aproximadamente 65% molar, succinil-paclitaxel de al menos aproximadamente 5% molar y un agente estabilizador de aproximadamente 0,1% (m/v) a aproximadamente 20% (m/v).

23. La preparación de una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 22 que comprende un azúcar o un alcohol como agente estabilizador, preferiblemente trehalosa.

24. La preparación de la reivindicación 18 a 23, que comprende un agente estabilizador en el intervalo de aproximadamente 5% (m/v) a aproximadamente 15% (m/v).

25. La preparación de la reivindicación 18 a 24, en donde dicha preparación de liposomas comprende liposomas con un tamaño medio de partícula de aproximadamente 50 nm a aproximadamente 400 nm, con preferencia aproximadamente 100 nm a aproximadamente 300 nm, cuando está presente en una solución acuosa.

26. La preparación de la reivindicación 18 a 25, en donde dicha preparación de liposomas comprende liposomas que tienen un potencial positivo zeta en solución de KCl aproximadamente 0,05M a aproximadamente pH 7,5 a la temperatura ambiente.

27. Una composición farmacéutica que comprende una preparación de liposomas de una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 26, junto con un vehículo, diluyente y/o adyuvante farmacéuticamente aceptable.

28. El uso de la preparación de liposomas de una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 26 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades asociadas con actividad angiogénica intensificada, preferiblemente cáncer, curación de heridas o inflamación crónica.