Un receptor P2X7 aislado, que comprende una secuencia de aminoácidos como se muestra en la Figura 1,

a condición de que la secuencia de aminoácidos del receptor P2X7 aislado contiene una prolina correspondiente a la prolina 210 mostrada en la Figura 1, estando dicha prolina en una conformación cis.

Diagnóstico y tratamiento de cánceres y otras afecciones.

CAMPO TÉCNICO

Esta invención se refiere al diagnóstico y tratamiento de enfermedades, incluyendo cánceres. Los tipos de enfermedades con los que está relacionada esta invención incluyen cánceres derivados de células epiteliales y linfoma maligno. La memoria también describe otras afecciones, tales como estados preneoplásicos, síndrome de intestino irritable e infecciones víricas y otras. Es muy posible que la invención también sea aplicable a otras enfermedades y afecciones.

ANTECEDENTES

La adenosina trifosfato (ATP) puede activar receptores purinérgicos regulados por ligando conocidos como receptores P2X. Se han identificado los subtipos de receptor P2X1 a P2X7. Se sabe que diferentes subtipos de receptor P2X están presentes en muchas células, incluyendo células epiteliales y leucocitos, que incluyen linfocitos, timocitos, macrófagos y células dendríticas.

Los receptores P2X son permeables a iones de calcio así como a algunos otros cationes, tales como potasio y sodio. Un flujo de entrada de iones de calcio en una célula a través de un receptor P2X puede asociarse con muerte celular.

Se piensa que el subtipo P2X7 está implicado en la apoptosis o muerte celular programada en muchos tipos celulares. En presencia de ATP, el receptor P2X7 expresado en la superficie de una célula es capaz, en un segundo, de abrir canales de calcio a través de la membrana celular. La exposición continua a ATP puede conducir a la formación de grandes poros, en un intervalo de unos pocos segundos a diez segundos, que permiten que la célula se sature con un exceso de calcio, induciendo la apoptosis.

Las secuencias de aminoácidos de los receptores P2X7 humano y de rata se conocen, por ejemplo, de la patente US Nº 6.133.434 (Buell et al.) . Remítase también a la Figura 1 en este documento.

Generalmente, la exposición a ATP no da como resultado una apoptosis en el caso de células cancerosas epiteliales, por ejemplo. Se ha descubierto que dichas células expresan receptores P2X7 que son incapaces de formar poros. Éstos se consideran receptores no funcionales.

En líneas celulares de cáncer humano, tales como PC3 de próstata y MCF7 de mama, así como en líneas celulares animales que incluyen hibridomas de roedores, el receptor P2X7 se encuentra en la superficie celular en una conformación no funcional.

Las células B de pacientes con linfoma maligno expresan receptores P2X7 no funcionales. El linfoma se desarrolla a partir de clones malignos que escapan a la destrucción citolítica. Este proceso conduce a la acumulación progresiva de linfocitos B malignos y, por lo tanto, a linfadenopatía y/o esplenomegalia.

La memoria describe una sonda para la detección de una enfermedad o afección, estando la sonda adaptada para distinguir entre receptores P2X7 funcionales y receptores P2X7 no funcionales. Preferiblemente, la sonda distingue entre receptores P2X7 funcionales y no funcionales mediante detección de un cambio en relación con la unión de adenosina trifosfato (ATP) a los receptores, o por detección de un cambio en la unión de una o más proteínas necesarias para la formación de poros en receptores P2X7. En una realización alternativa, la sonda detecta una o más partes del receptor P2X7 expuestas en ausencia de ATP unido. Dicha parte de receptor puede incluir un monómero de P2X7.

La memoria también describe un método para detectar una enfermedad o afección, incluyendo el método las etapas de usar la sonda de la invención para distinguir entre receptores P2X7 funcionales y receptores P2X7 no funcionales, proporcionar un perfil de expresión de receptor, y comparar el perfil de expresión de receptor con el de un perfil normal. El cambio puede detectarse, por ejemplo, como se ha indicado anteriormente en relación con la propia sonda.

La sonda puede ser natural o artificial. Preferiblemente, la sonda es un anticuerpo que puede ser policlonal, monoclonal, recombinante, un anticuerpo humanizado o un fragmento apropiado del mismo. El anticuerpo se dirige preferiblemente contra un epítopo localizado en un dominio extracelular adyacente a un sitio para la unión a ATP. En el caso de receptores P2X7 humanos, la sonda está preferiblemente adaptada para distinguir entre receptores funcionales que tienen una secuencia en la que la prolina del aminoácido 210 está en la conformación trans y receptores no funcionales que tienen una secuencia en la que la prolina del aminoácido 210 está en la conformación cis.

La sonda puede prepararse usando cualquier técnica adecuada, como será fácilmente evidente para un experto en la materia.

La sonda puede distinguir entre receptores funcionales y no funcionales mediante la detección de otros cambios conformacionales que ocurren en un sitio para unión a ATP. Por ejemplo, el cambio detectado puede ser en un aminoácido distinto de la prolina mencionada anteriormente. Un ejemplo de dicho aminoácido es Pro 199. Como otro ejemplo, el cambio detectado puede ser en algún otro sentido.

La sonda también puede estar adaptada para detectar otras regiones del receptor P2X7 no modificadas por el estado funcional. La conformación de las subunidades monoméricas que carecen de ATP unido puede ser detectable usando la sonda, puesto que el epítopo seleccionado puede detectar específicamente la forma de una región de la superficie del receptor accesible solamente cuando no está unido el ATP. La sonda puede detectar un cambio en la unión de una o más proteínas, tales como proteínas accesorias u otras, necesarias para la formación de poros. Ejemplos no limitativos de dichas proteínas son la laminina, la integrina, la beta-actina, la alfa-actinina y la supervilina.

En la presente invención, puede usarse un anticuerpo específico de subtipo P2X7 para detectar específicamente o unirse a receptores P2X7 no funcionales expresados en o sobre células que forman parte de tejido preneoplásico, tejido neoplásico muy temprano, tejido neoplásico avanzado y sobre cualquier célula neoplásica que exprese receptores P2X7 no funcionales. Por lo tanto, el receptor P2X7 se detecta o se une solamente cuando está en la conformación regulada cerrada o no funcional, aun cuando puede expresarse normalmente en las membranas celulares y de otro modo puede ser parcialmente capaz de funcionar como un canal.

Además, la conformación de las subunidades monoméricas que carecen de ATP unido también es detectable con el anticuerpo, porque el epítopo seleccionado detecta específicamente la forma de una región de la superficie accesible solamente cuando no está unido el ATP.

Los receptores P2X7 no funcionales pueden detectarse o unirse mediante el uso de un anticuerpo dirigido contra un epítopo que experimenta un cambio conformacional a partir de la estructura presente en receptores funcionales. Se ha descubierto que la secuencia de aminoácidos de los receptores no funcionales puede ser idéntica a la secuencia de aminoácidos de receptores funcionales, de modo que la causa del cambio conformacional en los receptores está relacionada con la interacción de los receptores con ATP. Como se ha expuesto anteriormente, las moléculas de ATP actúan como agonistas del receptor, de modo que cuando se une ATP a los receptores, estos son capaces de abrir un canal a través de la membrana celular para el flujo de entrada de iones de calcio. Por lo tanto, la no funcionalidad está causada por una ausencia de unión apropiada de los agonistas de ATP a los receptores, por razones que pueden incluir un déficit en la disponibilidad local de ATP por un déficit de producción o un aumento en la velocidad de degradación. Si se interrumpe altera la unión de ATP a los receptores, se altera la conformación del receptor. Esto puede detectarse mediante el uso de un anticuerpo especialmente diseñado para unirse a la región de la proteína afectada por la unión del ATP.

En el caso de receptores P2X7 humanos, la secuencia específica implicada en el cambio conformacional puede incluir la Pro210, que experimenta un cambio en la conformación de la forma trans a la forma cis en ausencia de ATP unido. Por lo tanto, en el caso de receptores humanos, una secuencia de epítopo apropiada contra la que debe generarse un anticuerpo puede incluir la Pro210, y puede abarcar cualquier lado de este residuo, en un grado apropiado necesario para inducir una respuesta de anticuerpos.

A modo de ejemplo no limitativo, ésta puede incluir... [Seguir leyendo]

1. Un receptor P2X7 aislado, que comprende una secuencia de aminoácidos como se muestra en la Figura 1, a condición de que la secuencia de aminoácidos del receptor P2X7 aislado contiene una prolina correspondiente a la prolina 210 mostrada en la Figura 1, estando dicha prolina en una conformación cis.

2. Un receptor P2X7 aislado, de acuerdo con la reivindicación 1, que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en la Figura 1, en la que la prolina en la posición 210 está en una conformación cis.

3. Un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos de un fragmento del receptor de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende los residuos 200 (Gly) a 215 (Thr) mostrados en la Figura 1, incluyendo dicha secuencia la prolina en la posición 210 en una conformación cis, para su uso en la prevención o el tratamiento de una enfermedad o afección.

4. Un péptido para su uso, de acuerdo con la reivindicación 3, que incluye adicionalmente un adyuvante.

5. Un péptido para su uso, de acuerdo con la reivindicación 3 ó 4, en la que dicha enfermedad es un cáncer seleccionado del grupo que consiste en cáncer de próstata, de mama, de piel, de pulmón, de cuello uterino, de útero, de estómago, de esófago, de vejiga, de colón, de vagina y de sangre, y linfoma maligno.

6. Un anticuerpo de oveja, de conejo o de ratón, que se une a un fragmento peptídico de un receptor P2X7 que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en los residuo.

20. 216 de la Figura 1 en la que la prolina en la posición 210 está en una conformación cis, en el que la Cys en la posición 216 del fragmento peptídico está acoplado a una toxina diftérica mediante el reticulador químico maleimidocaproil-N-hidroxisuccinimida (MCS) ; en el que el anticuerpo no se une a un dominio extracelular de un receptor P2X7 que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en la Figura 1 en la que la prolina en la posición 210 está en una conformación trans.

7. Una composición para su uso en la prevención o el tratamiento de una enfermedad o afección, en la que dicha composición se formula para administración tópica y comprende un anticuerpo, en el que dicho anticuerpo se une a un dominio extracelular de un receptor P2X7 que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en la Figura 1 en el que la prolina en la posición 210 está en una conformación cis y en el que el anticuerpo no se une a un dominio extracelular de un receptor P2X7 que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en la Figura 1 en el que la prolina en la posición 210 está en una conformación trans.

8. Una composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 7, en el que la composición se formula como una crema, solución, pomada, suspensión, polvo, comprimido, cápsula, supositorio o pesario.

9. Una composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 7 u 8, en el que la enfermedad o afección es cáncer de piel.

10. Una composición para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 7-9, en la que el anticuerpo está purificado por afinidad, en la que la composición se formula en una base de crema de dimeticona y en la que la enfermedad o afección es carcinoma de células basales humanas.

11. Un reactivo adecuado para detectar una enfermedad o afección por una técnica de formación de imágenes in vivo, comprendiendo dicho reactivo un anticuerpo que se une a un dominio extracelular de un receptor P2X7 que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en la Figura 1 con la condición de que la prolina en la posición 210 está en una conformación cis, en el que el anticuerpo no se une a un dominio extracelular de un receptor P2X7 que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en la Figura 1 en la que la prolina en la posición 210 está en una conformación trans.

12. Un método in vitro para determinar si un individuo padece una enfermedad o afección, comprendiendo dicho método:

(i) poner en contacto una muestra de células o de tejido de un individuo con un anticuerpo que se une a un dominio extracelular de un receptor P2X7 que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en la Figura 1 con la condición de que la prolina en la posición 210 está en una conformación cis, en el que el anticuerpo no se une a un dominio extracelular de un receptor P2X7 que tiene una secuencia de aminoácidos como se muestra en la Figura 1 en la que la prolina en la posición 210 está en una conformación trans; y

(ii) determinar si la célula o el tejido están unidos al anticuerpo;

en el que la muestra de células o de tejido es una muestra de linfa, de próstata, de mama, de piel, de pulmón, de útero, de vejiga, de cuello uterino, de estómago o de esófago.

13. Un método in vitro de acuerdo con la reivindicación 12, en el que la enfermedad o afección es un cáncer seleccionado del grupo que consiste en cáncer de próstata, de mama, de piel, de pulmón, de cuello uterino, de colon y de sangre y linfoma maligno.

REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIÓN

Esta lista de referencias citadas por el solicitante únicamente es para comodidad del lector. Dicha lista no forma parte del documento de patente europea. Aunque se ha tenido gran cuidado en la recopilación de las referencias, no se pueden excluir errores u omisiones y la EPO rechaza toda responsabilidad a este respecto.

Documentos de patentes citados en la descripción