Composición de vacuna que comprende un ARN modificado con caperuza 5''.

Composición de vacuna que comprende un ARN que es modificado con una estructura de caperuza 5' según la fórmula (I):

**Fórmula**

en la que R1 se selecciona de entre el grupo que consiste en alquilo sustituido opcionalmente, alquenilo sustituido opcionalmente, alquinilo sustituido opcionalmente, cicloalquilo sustituido opcionalmente, heterociclilo sustituido opcionalmente, arilo sustituido opcionalmente y heteroarilo sustituido opcionalmente,

R2 y R3 se seleccionan independientemente de entre el grupo que consiste en H, halo, OH y alcoxi sustituido opcionalmente, o R2 y R3 forman conjuntamente O-X-O, en el que X se selecciona de entre el grupo que consiste en CH2, CH2CH2, CH2CH2CH2, CH2CH(CH3) y C(CH3)2 sustituidos opcionalmente, o R2 se combina con el átomo de hidrógeno en la posición 4' del anillo al que se encuentra unido R2 para formar -O-CH2- o -CH2-O-,

R5 se selecciona de entre el grupo que consiste en S, Se y BH3,

R4 y R6 se seleccionan independientemente de entre el grupo que consiste en O, S, Se y BH3,

n es 1, 2 o 3,

en la que la configuración estereoquímica en el átomo de P que comprende el sustituyente R5 corresponde a la del átomo Pß del diastereómero D1 de beta-S-ARCA.

Composición de vacuna que comprende un ARN modificado con caperuza 5'

Campo técnico de la invención

La presente invención se refiere al campo de la vacunación basada en ácidos nucleicos. En particular, la presente invención se refiere a la estabilización del ARN mediante modificación, en particular en el contexto de la vacunación con ARN, y proporciona una composición de vacuna que comprende un ARN que se modifica con un análogo de caperuza 5', células presentadoras de antígenos inmaduras que comprenden dicho ARN, así como métodos para inducir una respuesta inmunológica en un individuo utilizando la composición de vacuna o las células presentadoras de antígeno inmaduras según la presente invención. Además, la presente invención proporciona un método para incrementar la estabilidad del ARN en las células presentadoras de antígeno inmaduras, un método para incrementar la expresión del ARN en células presentadoras de antígeno inmaduras, un método para incrementar la porción de moléculas del CMH que presentan un antígeno de interés y un método para estimular y/o activar las células efectoras inmunológicas.

Antecedentes de la invención

Las vacunas recombinantes resultan de particular importancia en la medicina humana y veterinaria para la profilaxis y la terapia de las enfermedades infecciosas y cancerosas. El objetivo de una inmunización con una vacuna recombinante es inducir una reacción inmunitaria específica contra un antígeno definido, que resulta eficaz para la prevención o la terapia de enfermedades definidas. Las vacunas recombinantes conocidas se basan en proteínas recombinantes, fragmentos de péptidos sintéticos, los virus recombinantes o los ácidos nucleicos.

Recientemente, las vacunas basadas en ADN y ARN han ganado en importancia. Se ha demostrado que la inyección intramuscular directa de ADN plasmídico resulta en una expresión duradera de los genes codificados (Wolff et al., Science 247:1465-1468, 199). Este resultado ha sido un incentivo importante en el campo para investigar adicionalmente la aplicabilidad de los ácidos nucleicos en inmunoterapia. Inicialmente se estudiaron las vacunas basadas en ADN contra patógenos infecciosos (Cox et al., J. Virol. 67:5664-5667, 1993; Davis et al., Hum. Mol. Genet. 2:1847-1851, 1993; Ulmer et al., Science 259:1745-1749, 1993; Wang et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 9:4156-416, 1993). Además, se ha estudiado la aplicabilidad de los ácidos nucleicos en la terapia génica contra tumores y para la inducción de una inmunidad específicamente antitumoral (Conry et al., Cáncer Res. 54:1164-1168, 1994; Conry et al., Gene Ther. 2:59-65, 1995; Spooner ef al., Gene Ther. 2:173-18, 1995; Wang et al., Hum. Gene Ther. 6:47-418, 1995).

La inmunización basada en ácidos nucleicos muestra varias ventajas. Por ejemplo, la preparación de vacunas basadas en ácidos nucleicos es sencilla, relativamente económica y las vacunas basadas en ADN son estables en el almacenamiento a largo plazo. Sin embargo, en particular las vacunas basadas en ADN muestran diversos riesgos potenciales de seguridad, tales como la inducción de anticuerpos anti-ADN (Gilkeson et al., J. Clin. Invest. 95:1398- 142, 1995) y la integración potencial del transgén en el genoma del huésped. Lo anterior puede conducir a la inactivación de los genes celulares, una expresión a largo plazo incontrolada del transgén, u oncogénesis, y de esta manera, generalmente no resulta aplicable a los antígenos asociados a tumor con potencial oncogénico, tales como erb-B2 (Bargmann et al., Nature 319:226-23, 1986) y p53 (Greenblatt et al., Cáncer Res. 54:4855-4878, 1994).

La utilización del ARN proporciona una alternativa atractiva para evitar los potenciales riesgos de las vacunas basadas en ADN. Algunas de las ventajas de la inmunización basada en ARN son la expresión transitoria y su carácter no transformante. Además, el ARN no necesita ser transportada hasta el interior del núcleo para que se exprese el transgén y, además, no puede integrarse en el genoma del huésped. De manera similar a la inyección de ADN (Condon et al., Nat. Med. 2:1122-1128, 1996; Tang et al., Nature 356:152-154, 1992), la inyección de ARN puede resultar en una respuesta inmunológica humoral tanto celular como humoral in vivo (Hoerr et al., Eur. J. Immunol. 3:1-7, 2; Ying et al., Nat. Med. 5:823-827, 1999).

Se han seguido dos estrategias diferentes para la inmunoterapia con ARN transcrito in vitro (ARN-IVT), las cuales han sido sometidas a ensayo con éxito en diversos modelos animales. El ARN se inyecta directamente en el paciente mediante diferentes vías de inmunización (Hoerr et al., Eur. J. Immunol. 3:1-7, 2) o se transfectan células dendríticas con ARN-IVT utilizando métodos convencionales de transfección in vitro y seguidamente las células dendríticas transfectadas se administran en el paciente (Heiser et al., J. Immunol. 164:558-5514, 2). Se ha demostrado que la inmunización con células dendríticas transfectadas con ARN induce linfocitos T citotóxicos (LTC) específicos de antígeno in vitro e in vivo (Su et al., Cáncer Res. 63:2127-2133, 23; Heiser et al., J. Clin. Invest. 19:49-417, 22). Además, se ha demostrado que la inyección directa de ARN desnudo en nodulos linfáticos de animales de laboratorio (inyección intranodal) conduce a la incorporación de dicho ARN principalmente por parte de células dendríticas inmaduras, probablemente mediante un proceso denominado macropinocitosis (ver documento DE 1 28 61 522.6). Se infiere que el ARN se traduce y que la proteína expresada es presentada sobre las moléculas de CMH sobre la superficie de las células presentadoras de antígeno, induciendo una respuesta inmunológica.

Una desventaja importante de la vacunación basada en ARN es la inestabilidad del ARN in vivo, en particular en células del sistema inmunológico. La degradación del ARN de cadena larga desde el extremo 5' es inducida en la célula por el enzima Dcp2 denominado "descaperuzante", que corta el mGDP de la cadena de ARN. De esta manera, se considera que el corte se produce entre los grupos alfa-fosfato y beta-fosfato de la caperuza del ARN.

Para inhibir el proceso de descaperuzado e incrementar de esta manera la estabilidad del ARN in vivo, se ha estudiado el efecto de los análogos de fosforotioato de caperuza sobre la estabilidad de dicho ARN. Se ha demostrado que la sustitución de un átomo de oxígeno por un átomo de azufre en el grupo beta-fosfato de la caperuza 5' resulta en la estabilización frente a Dcp2. La modificación fosforotioato de la caperuza 5' del ARN se ha combinado con una modificación de "análogos antiinversos de caperuza" (ARCA) que inhibe la integración inversa de la caperuza en la cadena del ARN. El análogo de caperuza resultante, es decir, nri2(72)Gpp3pG, ha sido denominado beta-S-ARCA (ver la figura 1). La sustitución de un átomo de oxígeno por un átomo de azufre en un fosfato de puente resulta en diastereómeros de fosforotioato que se denominan D1 y D2 basándose en su patrón de elución en HPLC. Resulta interesante que los dos diastereómeros difieren en su sensibilidad frente a nucleasas. Se ha demostrado que el ARN que porta el diastereómero D2 de beta-S-ARCA es prácticamente totalmente resistente frente al corte por Dcp2 (sólo un 6% de corte en comparación con ARN que ha sido sintetizado en presencia de caperuza 5' ARC no modificado), mientras que el ARN con la caperuza 5' beta-S-ARCA(DI) muestra una sensibilidad intermedia al corte con Dcp2 (71% de corte) (Grudzien-Nogalska et al., RNA 13:1745-1755, 27). Además, los tres análogos de caperuza ARCA, beta-S-ARCA(DI) y beta-S-ARCA(D2) difieren en su afinidad de unión al factor eucariótico de inicio de traducción elF4E. Ambos análogos de caperuza fosforotioato presentan una mayor afinidad para elF4E que los ARN que presentan caperuzas 5' convencionales. Se ha demostrado además que la estabilidad incrementada frente al corte por Dcp2 se correlaciona con una expresión de proteínas incrementada en células HC11. En particular, se ha demostrado que los ARN que porta la caperuza beta-S-ARCA(D2) se traducen más eficientemente en las células HC11 que los ARN que portan la caperuza beta-S-ARCA(DI) (Grundzien- Nogalska etai, RNA 13:1745-1755, 27).

Kowalska et al. (RNA 14:1119-1131, 28) también dan a conocer análogos anticaperuza inversa con sustituciones fosforotioato y enseña que únicamente los análogos modificados en el grupo gamma-fosfato son resistentes al corte por DcpS.

En resumen, el ARN resulta especialmente adecuado para las aplicaciones clínicas. Sin embargo, la utilización del ARN en la terapia génica y la vacunación con ARN se encuentra limitada principalmente por la corta semivida del ARN, en particular en el citoplasma, lo que resulta en... [Seguir leyendo]

1. Composición de vacuna que comprende un ARN que es modificado con una estructura de caperuza 5' según la fórmula (I):

en la que R1 se selecciona de entre el grupo que consiste en alquilo sustituido opcionalmente, alquenilo sustituido opcionalmente, alquinilo sustituido opcionalmente, cicloalquilo sustituido opcionalmente, heterociclilo sustituido opcionalmente, arilo sustituido opcionalmente y heteroarilo sustituido opcionalmente,

R2 y R3 se seleccionan independientemente de entre el grupo que consiste en H, halo, OH y alcoxi sustituido opcionalmente, o R2 y R3 forman conjuntamente O-X-O, en el que X se selecciona de entre el grupo que consiste en CH2, CH2CH2, CH2CH2CH2, CH2CH(CH3) y C(CH3)2 sustituidos opcionalmente, o R2 se combina con el átomo de hidrógeno en la posición 4' del anillo al que se encuentra unido R2 para formar -O-CH2- o -CH2-O-,

R5 se selecciona de entre el grupo que consiste en S, Se y BH3,

R4 y R6 se seleccionan independientemente de entre el grupo que consiste en O, S, Se y BH3, n es 1,2 o 3,

en la que la configuración estereoquímica en el átomo de P que comprende el sustituyente R5 corresponde a la del átomo P(3 del diastereómero D1 de beta-S-ARCA.

2. Composición de vacuna según la reivindicación 1, en la que la estructura de caperuza 5' tras la transferencia de dicho ARN al interior de unas células presentadoras de antígeno inmaduras puede incrementar la estabilidad del ARN, incrementar la eficiencia de traducción del ARN, prolongar la traducción del ARN, incrementar la expresión de proteínas total del ARN y/o incrementar la respuesta inmunológica contra un antígeno o péptido antigénico codificado por dicho ARN cuando se compara con el mismo ARN sin la estructura de caperuza 5' según la fórmula

(O-

3. Composición de vacuna según la reivindicación 1 o 2, en la que R1 se selecciona de entre el grupo que consiste en alquilo C1-C4 sustituido opcionalmente, alquenilo C2-C4 sustituido opcionalmente y arilo sustituido opcionalmente.

4. Composición de vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que R2 y R3 se seleccionan independientemente de entre el grupo que consiste en H, F, OH, metoxi, etoxi y propoxi.

5. Composición de vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que la caperuza 5' del ARN es el diastereómero D1 de beta-S-ARCA.

6. Composición de vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que es formulada para la inyección intranodal.

7. Célula presentadora de antígeno inmadura que comprende un ARN que es modificado con una estructura de caperuza 5' según la fórmula (I):

en la que R1 se selecciona de entre el grupo que consiste en alquilo sustituido opcionalmente, alquenilo sustituido opcionalmente, alquinilo sustituido opcionalmente, cicloalquilo sustituido opcionalmente, heterociclilo sustituido opcionalmente, arilo sustituido opcionalmente y heteroarilo sustituido opcionalmente,

R2 y R3 se seleccionan independientemente de entre el grupo que consiste en H, halo, OH y alcoxi sustituido opcionalmente, o R2 y R3 forman conjuntamente O-X-O, en el que X se selecciona de entre el grupo que consiste en CH2, CH2CH2, CH2CH2CH2, CH2CH(CH3) y C(CH3)2 sustituidos opcionalmente, o R2 se combina con el átomo de hidrógeno en la posición 4' del anillo al que se encuentra unido R2 para formar -O-CH2- o -CH2-O-,

R5 se selecciona de entre el grupo que consiste en S, Se y BH3,

R4 y R6 se seleccionan independientemente de entre el grupo que consiste en O, S, Se y BH3, n es 1,2 o 3,

en la que la configuración estereoquímica del átomo de P que comprende el sustituyente R5 corresponde a la del átomo P(3 del diastereómero D1 de beta-S-ARCA.

8. Composición de vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o célula presentadora de antígeno inmadura según la reivindicación 7 para la utilización en un método para inducir una respuesta inmunitaria en un individuo.

9. ARN con una estructura de caperuza 5' según la fórmula (I):

en la que R1 se selecciona de entre el grupo que consiste en alquilo sustituido opcionalmente, alquenilo sustituido opcionalmente, alquinilo sustituido opcionalmente, cicloalquilo sustituido opcionalmente, heterociclilo sustituido opcionalmente, arilo sustituido opcionalmente y heteroarilo sustituido opcionalmente,

R2 y R3 se seleccionan independientemente de entre el grupo que consiste en H, halo, OH y alcoxi sustituido opcionalmente, o R2 y R3 forman conjuntamente O-X-O, en el que X se selecciona de entre el grupo que consiste en CH2, CH2CH2, CH2CH2CH2, CH2CH(CH3) y C(CH3)2 sustituidos opcionalmente, o R2 se combina con el átomo de hidrógeno en la posición 4' del anillo al que se encuentra unido R2 para formar -O-CH2- o -CH2-O-,

R5 se selecciona de entre el grupo que consiste en S, Se y BH3,

R4 y R6 se seleccionan independientemente de entre el grupo que consiste en O, S, Se y BH3, n es 1,2 o 3,

en la que la configuración estereoquímica del átomo de P que comprende el sustituyente R5 corresponde a la del átomo Pp del diastereómero D1 de beta-S-ARCA.

para la utilización en un método para incrementar la estabilidad de un ARN en unas células presentadoras de antígeno inmaduras y/o para incrementar la expresión de un ARN en unas células presentadoras de antígeno inmaduras, comprendiendo dicho método: transferir dicho ARN al interior de las células presentadoras de antígeno inmaduras.

1. ARN que comprende una secuencia de nucleótidos codificante de un péptido o proteína que comprende dicho antígeno de interés o un péptido antigénico del mismo, estando dicho ARN modificado con una estructura de caperuza 5' según la fórmula (I):

en la que R1 se selecciona de entre el grupo que consiste en alquilo sustituido opcionalmente, alquenilo sustituido opcionalmente, alquinilo sustituido opcionalmente, cicloalquilo sustituido opcionalmente, heterociclilo sustituido opcionalmente, arilo sustituido opcionalmente y heteroarilo sustituido opcionalmente,

R2 y R3 se seleccionan independientemente de entre el grupo que consiste en H, halo, OH y alcoxi sustituido opcionalmente, o R2 y R3 forman conjuntamente O-X-O, en el que X se selecciona de entre el grupo que consiste en CH2, CH2CH2, CH2CH2CH2, CH2CH(CH3) y C(CH3)2 sustituidos opcionalmente, o R2 se combina con el átomo de hidrógeno en la posición 4' del anillo al que se encuentra unido R2 para formar -O-CH2- o -CH2-O-,

R5 se selecciona de entre el grupo que consiste en S, Se y BH3,

R4 y R6 se seleccionan independientemente de entre el grupo que consiste en O, S, Se y BH3, n es 1,2 o 3,

en la que la configuración estereoquímica del átomo de P que comprende el sustituyente R5 corresponde a la del átomo Pp del diastereómero D1 de beta-S-ARCA.

para la utilización en un método para incrementar la porción de moléculas de CMH que presentan un antígeno de interés sobre la superficie de una célula presentadora de antígeno, comprendiendo dicho método: transferir dicho ARN al interior de una célula presentadora de antígeno inmadura.

11. ARN que comprende una secuencia de nucleótidos codificante de un péptido o proteína que comprende un antígeno de interés o un péptido antigénico del mismo, estando dicho ARN modificado con una estructura de caperuza 5' según la fórmula (I):

en la que R1 se selecciona de entre el grupo que consiste en alquilo sustituido opcionalmente, alquenilo sustituido opcionalmente, alquinilo sustituido opcionalmente, cicloalquilo sustituido opcionalmente, heterociclilo sustituido opcionalmente, arilo sustituido opcionalmente y heteroarilo sustituido opcionalmente,

R2 y R3 se seleccionan independientemente de entre el grupo que consiste en H, halo, OH y alcoxi sustituido opcionalmente, o R2 y R3 forman conjuntamente O-X-O, en el que X se selecciona de entre el grupo que consiste en CH2, CH2CH2, CH2CH2CH2, CH2CH(CH3) y C(CH3)2 sustituidos opcionalmente, o R2 se combina con el átomo de hidrógeno en la posición 4' del anillo al que se encuentra unido R2 para formar -O-CH2- o -CH2-O-,

R5 se selecciona de entre el grupo que consiste en S, Se y BH3,

R4 y R6 se seleccionan independientemente de entre el grupo que consiste en O, S, Se y BH3, n es 1,2 o 3,

en la que la configuración estereoquímica del átomo de P que comprende el sustituyente R5 corresponde a la del átomo Pp del diastereómero D1 de beta-S-ARCA, para la utilización en un método para estimular y/o activar las células efectoras inmunitarias, comprendiendo dicho método:

transferir dicho ARN al interior de unas células presentadoras de antígeno inmaduras, y poner en contacto las células presentadoras de antígeno con las células efectoras inmunitarias.

12. ARN para la utilización según la reivindicación 11, en el que la puesta en contacto de las células presentadoras de antígeno con las células efectoras inmunitarias se lleva a cabo in vitro o in vivo.

13. ARN que comprende una secuencia de nucleótidos codificante de un péptido o proteína que comprende un antígeno de interés o un péptido antigénico del mismo, estando dicho ARN modificado con una estructura de caperuza 5' según la fórmula (I):

en la que R1 se selecciona de entre el grupo que consiste en alquilo sustituido opcionalmente, alquenilo sustituido opcionalmente, alquinilo sustituido opcionalmente, cicloalquilo sustituido opcionalmente, heterociclilo sustituido opcionalmente, arilo sustituido opcionalmente y heteroarilo sustituido opcionalmente,

R2 y R3 se seleccionan independientemente de entre el grupo que consiste en H, halo, OH y alcoxi sustituido opcionalmente, o R2 y R3 forman conjuntamente O-X-O, en el que X se selecciona de entre el grupo que consiste en CH2, CH2CH2, CH2CH2CH2, CH2CH(CH3) y C(CH3)2 sustituidos opcionalmente, o R se combina con el átomo de hidrógeno en la posición 4' del anillo al que se encuentra unido R2 para formar -O-CH2- o -CH2-O-,

R5 se selecciona de entre el grupo que consiste en S, Se y BH3,

R4 y R6 se seleccionan independientemente de entre el grupo que consiste en O, S, Se y BH3,

n es 1, 2 o 3,

en la que la configuración estereoquímica del átomo de P que comprende el sustituyente R5 corresponde a la del átomo Pp del diastereómero D1 de beta-S-ARCA,

para la utilización en un método para inducir una respuesta inmunitaria en un individuo.

14. ARN para la utilización según la reivindicación 13, que se administra mediante inyección intranodal.

15. Célula presentadora de antígeno inmadura según la reivindicación 7, para la utilización en un método para 2 inducir una respuesta inmunitaria en un individuo, en la que dicho ARN ha sido transferido al interior de dichas

células presentadoras de antígeno inmaduras.