ACTIVACIÓN LOCAL SELECTIVA DE MIEMBROS DE LA FAMILIA DE LIGANDOS TNF DE PROTEÍNAS DE FUSIÓN DEL LIGANDO TNF SIN ANTICUERPOS SISTÉMICAMENTE INACTIVAS.

Activación local selectiva de miembros de la familia de ligandos TNF de proteínas de fusión del ligando TNF sin anticuerpos sistémicamente inactivas. La presente invención se refiere a polipéptidos que comprenden un dominio efector y uno de fijación a la molécula a la superficie de la célula que están unidos por un enlazador peptídico. El dominio efector es un fragmento, en particular el dominio extracelular, de un miembro de la familia del ligando TNF (módulo 1) que como tal es biológicamente inactivo o de actividad limitada. El dominio de unión de la molécula de la superficie de la célula (módulo 2) es una segmento de aminoácidos que se une selectivamente a una estructura de la superficie de la membrana plasmática, de preferencia a una proteína de la membrana, pero que no procede de la inmunoglobulina. Además, la invención proporciona montajes de ácido nucleico que codifican los polipéptidos, vectores que los contienen, células hospedadoras transfectadas con los mismos, composiciones farmacéuticas que contienen dichas materias de la invención, procedimientos para la producción de los polipéptidos según la invención y utilizaciones de las materias de la invención con fines terapéuticos. En estudios in vitro, las citocinas, por ejemplo los miembros de la familia del ligando TNF, por ejemplo TRAIL (TNF Related Apoptosis Inducing Ligand), denominado también Apo2L (Wiley et al. (1995), Immunity 6: 673-682, Pitti et al. (1996) J. Biol. Chem. 271: 12687-12689), y por ejemplo FasL tiene una potente acción apoptósica en muchas células tumorales de origen animal y humano. En el caso de TRAIL, parece que no están afectadas las células malignas. Además, en los modelos animales preclínicos estudiados (ratón, mono) no se observaron indicaciones en absoluto de toxicidad aguda o de otros efectos secundarios generales de TRAIL, que puedan considerarse restrictivas de la terapia (Walczack et al. (1999) Nat. Med. 5:157-163, Ashkenazy et al. (1999) J. Clin. Invest. 104: 155-162). Sin embargo, recientes estudios in vitro en hepatocitos humanos primarios indicaron una potente acción citotóxica en el caso de un producto TRAIL producido de manera recombinante o de TRAIL localizado en la membrana, forma natural de esta ci9tocina (Jo et al. (2000) Nat. Med. 6: 564-567, Ichikawa et al. (2001) Nat. Med. 7: 954-960). Por consiguiente, actualmente una aplicación clínica general de variantes solubles especiales de miembros de la familia del ligando TNF (en particular TNF, FasL, TRAIL y CD40L), que son biológicamente activos y por consiguiente esencialmente tienen la acción de los ligandos localizados en la membrana, está regulada debido a los efectos secundarios que se producen. Lo mismo se aplica a los anticuerpos agonísticos que activan los receptores correspondientes a estos ligandos. Así, por ejemplo, para FasL (ligando del receptor Fas (Fas, CD95)), prototipo de citocinas apoptósicas, no se llevó a cabo una aplicación clínica a priori por razones de seguridad, ya que los anticuerpos agonísticos contra su receptor, Fas, son sumamente hepatotóxicos in vivo (Ogasawara et al. (1993) Nature 364: 806-809). Por último, ha sido posible también demostrar que FasL en forma soluble, en contraste con su forma localizada en la membrana, no tiene prácticamente actividad biológica (Scheneider et al. (1998) J. Exp. Med. 187: 1205-1213). Por lo tanto, las variantes de los miembros de la familia del ligando TNF disponibles según el estado de la técnica no son utilizables o solamente en un grado muy limitado (por ejemplo en el caso del TNF en las denominadas condiciones de perfusión aislada de la extremidad) para aplicación terapéutica, por ejemplo, para el tratamiento de tumores, ya sea debido a la falta de actividad biológica o debido a efectos secundarios extremos. El documento WO 02/22680 da a conocer proteínas de fusión, en las que los fragmentos que como tales no son biológicamente activos o solamente en un grado limitado, por ejemplo de citocinas de TNF, están unidos mediante un enlazador peptídico a un anticuerpo que se une al antígeno o a un fragmento que se une al antígeno del mismo. Sin embargo, existe la necesidad de proporcionar sistemas alternativos, ya que con cierta frecuencia no existe ningún anticuerpo (o fragmentos de anticuerpo) correspondiente disponible para determinadas moléculas de la superficie celular, u otro antígeno que se une tiene lugar como es de esperar, por ejemplo sin la especificidad apropiada. La presente invención se basa en el objetivo de proporcionar un sistema alternativo, en particular independiente de anticuerpos, con lo que es posible manifestar la acción de ligandos de la familia TNF (o fragmentos de los mismos) de manera orientada y específica para el tejido y las células y por lo tanto evitar o por lo menos limitar notablemente determinados efectos secundarios generales sobre las células y tejidos que no pertenecen al tejido diana durante la utilización clínica. Este problema se resuelve mediante las formas de realización de la presente invención caracterizadas en las reivindicaciones. Según la presente invención, se proporciona un polipéptido que comprende un segmento (1) que contiene un dominio de unión a la molécula de la superficie celular (denominado también módulo 2) en el que el dominio que se une a la molécula de la superficie celular no procede de una inmunoglobulina, de un segmento (2), que es un enlazador peptídico ni de un segmento (3), que contiene un fragmento de un miembro de la familia del ligando TNF (denominado también citocinas del TNF o familia del ligando receptor de TNF) que como tal es biológicamente inactivo/de actividad restringida (denominado también módulo 1) en el que el fragmento en el segmento (3) tiene un dominio extracelular de un miembro de la familia del ligando TNF o una variante de la secuencia natural del dominio 2 ES 2 365 691 T3 extracelular que tiene por lo menos el 80% de homología de secuencia, y en el que el fragmento en el segmento (3) solo se vuelve biológicamente activo por completo mediante la unión del segmento (1) a la molécula de la superficie celular. Según una forma de realización preferida, los segmentos (1) a (3) en el polipéptido (= proteína de fusión según la invención = montaje de proteína según la invención) se ordenan desde el terminal N al C. La presente invención se basa en la observación de que los ligandos de la familia TNF natural en la membrana, cuando son procesados proteolíticamente por el organismo en una forma soluble correspondiente al dominio extracelular, son biológicamente inactivos por completo, o son solo todavía activos en un grado restringido, por ejemplo en determinados subtipos del receptor de membrana. Esto también aplica a los derivados producidos de manera recombinante que corresponden a los dominios extracelulares de los ligandos en cuestión. Significativamente, dichos ligandos solubles, biológicamente inactivos son todavía absolutamente capaces de unirse a su receptor de membrana complementario, sin efectuar sin embargo una activación del receptor, es decir la transducción de señal y la activación de una reacción celular. El descubrimiento según la invención consiste en que dicho ligando que es inactivo y de actividad restringida (módulo 1) por fusión con un componente peptídico adicional (módulo 2), que no consta de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo y que permite una unión específica a una estructura situada en una membrana celular independiente de la fracción del ligando TNF, alcanza de nuevo actividad biológica (completa), si este componente peptídico conduce a la unión a una superficie celular. La reconstitución de la acción biológica del módulo 1 lograda de este modo se vuelve activa tanto contra las propias células diana reconocidas por el módulo 2 como también contra las células adyacentes, con tal que cada una de éstas exprese los receptores apropiados para el fragmento del ligando TNF (módulo 1) contenido en la proteína de fusión. El dominio de unión a la molécula de la superficie celular (segmento (1) o módulo (2)) de la proteína de fusión según la invención media en la unión de la proteína de fusión a las células que tienen la estructura superficial apropiada. La invención se diferencia en base a los módulos específicos por dos propiedades que dan como resultado que toda la proteína adquiere propiedades que ninguno de los módulos utilizados posee solo y que no son previsibles. La primera propiedad que se refiere a esto es que el dominio de unión a la molécula de la superficie celular en la proteína de fusión no se consigue por el principio de la utilización de anticuerpos o fragmentos procedentes de la misma (por ejemplo scFv) correspondiente al estado actual de la tecnología, pero mejor que en contraste con los dominios de anticuerpos que se unen al antígeno... [Seguir leyendo]

1. Polipéptido que comprende un segmento (1), que contiene un dominio de unión a la molécula de la superficie celular, no procediendo el dominio que se une a la molécula de la superficie celular de una inmunoglobulina, un segmento (2), que es un enlazador peptídico, y un segmento (3), que contiene un fragmento de un miembro de la familia del ligando TNF que como tal es biológicamente inactivo/de actividad restringida, en el que el fragmento en el segmento (3) contiene un dominio extracelular de un miembro de la familia del ligando TNF o una variante que presenta por lo menos el 80% de homología de secuencia de la secuencia natural del dominio extracelular, y en el que el fragmento en el segmento (3) se vuelve biológicamente activo por completo sólo cuando el segmento (1) se une a la molécula de la superficie celular. 2. Polipéptido según la reivindicación 1, en el que los segmentos (1) a (3) están dispuestos desde el terminal N al terminal C. 3. Polipéptido según la reivindicación 2, en el que el segmento (3) contiene el dominio extracelular de TRAIL, FasL, TNF, 41BBL, CD40L, CD30L u Ox40L. 4. Polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el dominio de unión a la molécula de la superficie celular se une a una proteína de la membrana. 5. Polipéptido según la reivindicación 4, en el que el dominio de unión a la molécula de la superficie celular comprende por lo menos el segmento de un ligando de un receptor localizado en la membrana que se requiere para la interacción específica con la molécula de la superficie celular. 6. Polipéptido según la reivindicación 5, en el que el ligando es un péptido u hormona proteica que se une al receptor o un fragmento de una citocina que se une al receptor. 7. Polipéptido según la reivindicación 6, en el que el fragmento de citocina es un fragmento de un miembro de la familia del ligando del TNF, con la condición de que sea diferente el miembro de la familia del ligando TNF del que proceden los segmentos (1) y (3). 8. Polipéptido según la reivindicación 6, en el que la hormona se selecciona de entre el grupo constituido por factores de crecimiento, en particular EGF, y factores de angiogenia, en particular VEGF. 9. Polipéptido según la reivindicación 4, en el que el dominio de unión a la molécula de la superficie celular comprende por lo menos el segmento de un receptor para un ligando localizado en la membrana que se requiere para la interacción específica con la molécula de la superficie celular, con la condición de que el segmento receptor no esté unido al dominio extracelular del miembro de la familia del ligando del TNF según el segmento (3). 10, Polipéptido según la reivindicación 9, en el que el receptor se selecciona de la superfamilia del receptor del TNF. 11. Polipéptido según la reivindicación 9 ó 10, en el que el receptor se selecciona de entre el grupo constituido por TNF-R2, CD30, CD40 Y CD28. 12. Montaje de ácido nucleico que contiene una secuencia nucleotídica que codifica un polipéptido según una de las reivindicaciones anteriores. 13. Vector, que contiene un montaje de ácido nucleico según la reivindicación 12. 14. Célula hospedadora, que contiene el montaje de ácido nucleico según la reivindicación 12 y/o el vector según la reivindicación 13. 15. Procedimiento para el aislamiento de un polipéptido según una de las reivindicaciones 1 a 11, en el que (a) se prepara un vector según la reivindicación 13 o un ácido nucleico según la reivindicación 12, (b) se transfectan células con un vector o se obtiene el montaje de ácido nucleico según el procedimiento de la etapa (a), (c) se cultivan las células transfectadas según el apartado (b), y (d) los polipéptidos expresados en condiciones apropiadas se aíslan de las células hospedadoras y/o del sobrenadante del cultivo. 16. Polipéptido según una de las reivindicaciones 1 a 11, montaje de ácido nucleico según la reivindicación 12, vector según la reivindicación 13 o célula hospedadora según la reivindicación 14 como medicamento. 13 ES 2 365 691 T3 17. Polipéptido según una de las reivindicaciones 1 a 11, montaje de ácido nucleico según la reivindicación 12, vector según la reivindicación 13 o célula hospedadora según la reivindicación 14 para su utilización en el tratamiento de enfermedades cancerosas, en particular de tumores sólidos o linfáticos, enfermedades infecciosas, 5 enfermedades metabólicas, cuadros inflamatorios y enfermedades autoinmunitarias, en particular reumáticas o artríticas. 18. Composición farmacéutica que contiene por lo menos un polipéptido según una de las reivindicaciones 1 a 11 y/o un montaje de ácido nucleico según la reivindicación 12 y/o un vector según la reivindicación 13 y/o células 10 hospedadoras según la reivindicación 14, así como sustancias auxiliares, aditivos y/o excipientes farmacéuticamente aceptables. 19. Composición farmacéutica según la reivindicación 18 para su utilización en el tratamiento de enfermedades cancerosas, en particular de tumores sólidos o linfáticos, enfermedades infecciosas, enfermedades metabólicas, 15 cuadros inflamatorios y enfermedades autoinmunitarias, en particular reumáticas o artríticas. 14 ES 2 365 691 T3