Utilización de ligando Flt3 para reforzar las respuestas inmunológicas en la inmunización con ARN.

Preparación inmunogénica, que comprende ARN, que codifica por lo menos un antígeno, y ligando de Flt3.

Utilización de ligando Flt3 para reforzar las respuestas inmunológicas en la inmunización con ARN.

La invención se refiere al campo de la vacunación y de la inmunoestimulación mediante la utilización de ARN, en particular ARNm, que codifica uno o más antígenos, que se asocian, por ejemplo, con enfermedades infecciosas o enfermedades malignas tales como el cáncer.

El sistema inmunológico puede mostrar inmunidad tanto específica como no específica. En general, la inmunidad específica es producida por los linfocitos B y T, que presentan, sobre su superficie celular, receptores específicos para un antígeno particular. El sistema inmunológico puede reaccionar a diferentes antígenos de dos maneras diferentes: (i) inmunidad humoral, que incluye la estimulación de células B y la producción de anticuerpos o inmunoglobulinas, e (ii) inmunidad mediada por células, que generalmente incluye células T, incluyendo los linfocitos T citotóxicos (LTC) .

Las reacciones de células T específicas de antígeno son producidas por péptidos antigénicos, que se unen al surco de unión de las glucoproteínas del complejo mayor de histocompatibilidad (CMH) , como parte del mecanismo del sistema inmunológico por el que se identifican los antígenos y se induce una reacción contra ellos. Los péptidos antigénicos unidos interactúan con los receptores de las células T y modulan de esta manera una respuesta inmunológica. Los péptidos antigénicos se unen no covalentemente a "bolsillos de unión" particulares, que se forman a partir de residuos polimórficos del surco de unión de la proteína de CMH.

Las moléculas del CMH de clase II son glucoproteínas heterodiméricas, que consisten de cadenas α y β. Los dominios α1 y β1 de estas moléculas se pliegan reuniéndose y formando un surco de unión a péptidos. Los péptidos antigénicos se unen a la molécula del CMH mediante interacción entre aminoácidos de anclaje sobre el péptido y los dominios α1 y β1. Las moléculas del CMH de clase I presentan disposiciones de los dominios diferentes de las de las moléculas del CMH de clase II, aunque generalmente presentan una estructura similar con un sitio o surco de unión a péptidos que se encuentra lejos de los dominios membranales.

La etapa inicial en la presentación de un antígeno proteína foránea es la unión del antígeno nativo a una célula presentadora de antígeno (CPA) . Tras la unión a las CPA, los antígenos penetran en las células, mediante fagocitosis, endocitosis mediada por receptores o pinocitosis. Estos antígenos internalizados se localizan en vesículas intracelulares unidas a la membrana que se denominan endosomas. Tras la fusión de endosomaslisosomas, los antígenos son procesados en péptidos pequeños por proteasas celulares localizadas en los lisosomas. Los péptidos se asocian con las cadenas α y β de las moléculas del CMH de clase II dentro de estos lisosomas. Estas moléculas del CMH de clase II, que habían sido sintetizadas previamente en el retículo endoplasmático rugoso, son transportadas secuencialmente a los complejos de Golgi y después al compartimiento lisosómico. El complejo de péptido-CMH es presentado sobre la superficie de las CPA para la activación de las células T y B.

La inmunidad no específica comprende diversas células y mecanismos, tales como la fagocitosis por macrófagos o granulocitos, y la actividad de células asesinas naturales (NK) . La inmunidad no específica se basa en mecanismos que no han avanzado tanto en términos evolutivos y no presenta las propiedades de especificidad y capacidad de memoria, las cuales son características importantes de una respuesta inmunológica específica.

Las vacunas recombinantes resultan especialmente importantes en medicina humana y veterinaria como sustancias activas y productos medicinales para la profilaxis y el tratamiento de enfermedades infecciosas y el cáncer. El objetivo de la vacunación con una vacuna recombinante es inducir una respuesta inmunológica específica a un antígeno definido, proporcionando un efecto preventivo o terapéutico contra enfermedades definidas.

Tras demostrar que la inyección intramuscular directa de ADN plasmídico conducía a la expresión prolongada de los genes codificados sobre la superficie celular (Wolff, J. A. et al., Science 247:1465-1468, 1990) , las vacunas basadas en ADN se presentaron como una nueva y prometedora estrategia de inmunización. Estas observaciones fueron un importante incentivo para el desarrollo de vacunas basadas en ácidos nucleicos. En primer lugar, las vacunas basadas en ADN se probaron contra patógenos infecciosos (Cox G.J. et al., J. Virol. 67:5664-5667, 1993; Davis H.L. et al., Hum. Mol. Genet. 2:1847-1851, 1993; Ulmer J.B., Science 259:1745-1749, 1993; Wang B. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:4156-4160, 1993) , aunque pronto también se llevó a cabo investigación sobre la terapia génica contra tumores para inducir una inmunidad antitumoral específica (Conr y , R. M. et al., Cancer Res. 54:1164-1168, 1994; Conr y R.M. et al., Gene Ther. 2:59-65, 1995; Spooner R.A. et al., Gene Ther. 2:173-180, 1995; Wang B. et al., Hum. Gene Ther. 6:407-418, 1995) . Esta estrategia de inmunización tumoral presenta varias ventajas decisivas. Las vacunas basadas en ácidos nucleicos son fáciles de fabricar y relativamente económicas. Además, pueden amplificarse a partir de un número reducido de células.

El ADN es más estable que el ARN pero comporta algunos potenciales riesgos de seguridad, tales como la inducción de anticuerpos anti-ADN (Gilkeson G.S. et al., J. Clin. Invest. 95:1398-1402, 1995) y la integración del transgén en el genoma del huésped. Esto puede conducir a la inactivación de genes celulares, a una expresión a largo plazo incontrolable del transgén, u oncogénesis, y por lo tanto no puede utilizarse de manera general para los antígenos asociados a tumor con potencial oncogénico tales como, por ejemplo, erb-B2 (Bargmann C.I. et al., Nature 319:226-230, 1986) y p53 (Greenblatt M.S. et al., Cancer Res. 54:4855-4878, 1994) . Para evitar estos riesgos potenciales, la utilización de ARN ofrece una alternativa atractiva.

Entre las ventajas del ARN como forma de terapia génica reversible se incluyen la expresión temporal y el carácter no transformante. No resulta necesario que el ARN entre en el núcleo para expresarse transgénicamente y además no puede integrarse en el genoma del huésped, de manera que se elimina el riesgo de oncogénesis. Al igual que con el ADN (Condon C. et al., Nat. Med. 2:122-1128, 1996; Tang D.C. et al., Nature 356:152-154, 1992) , también puede inducirse in vivo mediante inyección de ARN una respuesta inmunológica tanto celular como humoral (Hoerr I. et al., Eur. J. Immunol. 30:1-7, 2000; Ying H. et al., Nat. Med. 5:823-827, 1999) .

Para la inmunoterapia con ARN transcrito in vitro (ARN-TIV) o ARN amplificado in vitro, se siguen dos estrategias diferentes, ambas probadas con éxito en diversos modelos animales y que han encontrado aplicación preliminar en el ser humano.

Se transfectan células dendríticas (CD) con el ARN transcrito in vitro mediante lipofección o electroporación y después se aplican (Heiser A., J. Immunol. 164:5508-5514, 2000) o el ARN se inyecta directamente por diversas vías de inmunización (Hoerr I. et al., Eur. J. Immunol. 30:1-7, 2000; Granstein R.D. et al., Journal of Investigative Dermatology 114:632-636, 2000; Conr y R.M., Cancer Research 55:1397-1400, 1995) . Se ha demostrado que la inmunización con CD transfectadas por ARN induce LTC específicas de antígeno in vitro e in vivo (Su Z., Cancer Res. 63:2127-2133, 2003; Heiser A. et al., J. Clin. Invest. 109:409-417, 2002) . Los datos clínicos preliminares sobre la utilización de células dendríticas transfectadas por ARN como vacuna temporal se remontan a los años 2001 y 2002 y han demostrado que pueden inducirse células T específicas de antígeno en pacientes tumorales (Heiser A. et al., J. Clin. Invest. 109:409-417, 2002; Rains N., Hepato-Gastroenterology 48:347-351, 2001) . Para la inyección intradérmica directa de ARN en pacientes, de momento se dispone de los datos preliminares de un estudio clínico de fase I/II con pacientes de melanoma (Weide B., Journal of Immunotherapy 31:180-188, 2008) . Este estudio ha demostrado la seguridad y baja toxicidad de la inyección de ARN desnudo. Basándose en los datos preclínicos, que habían demostrado una inmunidad de TH-1 mejorada tras la administración de FEC-GM, se utilizó FEC-GM como adyuvante (Carralot, J. P. et al., Cell Mol. Life Sci. 61:2418-2424, 2004) . Sin embargo, no se observó ningún efecto clínico en los pacientes de melanoma tratados.

Por lo tanto, las vacunas de ARN pueden utilizarse... [Seguir leyendo]

1. Preparación inmunogénica, que comprende ARN, que codifica por lo menos un antígeno, y ligando de Flt3.

2. Preparación inmunogénica según la reivindicación 1, en la que el ARN es ARNm.

3. Preparación inmunogénica según la reivindicación 1 o 2, en la que el ARN se obtuvo mediante transcripción in vitro.

4. Preparación inmunogénica según una de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende además por lo menos un factor estabilizador del ARN.

5. Composición farmacéutica, que comprende una preparación inmunogénica según una de las reivindicaciones 1 a

4.

6. Composición farmacéutica según la reivindicación 5 en forma de una formulación como vacuna.

7. Ligando de Flt3 para su utilización en un procedimiento para producir o intensificar una respuesta inmunológica en un individuo, que comprende la administración de ARN que codifica por lo menos un antígeno, contra el cual debe dirigirse la respuesta inmunológica y una administración de ligando de Flt3.

8. Ligando de Flt3 según la reivindicación 7, en el que la respuesta inmunológica comprende una respuesta inmunológica de células T específicas de antígeno.

9. Ligando de Flt3 para su utilización en un procedimiento destinado a incrementar la cantidad de células efectoras específicas de antígeno en un individuo, que comprende la administración de ARN que codifica el antígeno, y una administración de ligando de Flt-3.

10. Ligando de Flt3 según la reivindicación 9, en el que las células efectoras específicas de antígeno son células T citotóxicas CD8+ y/o células T auxiliares CD4+.

11. Ligando de Flt3 para su utilización en un procedimiento destinado a la prevención y/o al tratamiento del cáncer en un individuo, que comprende una administración de ARN, que codifica un antígeno tumoral, contra el cual debe dirigirse la respuesta inmunológica y una administración de ligando de Flt3.

12. Ligando de Flt3 para su utilización en un procedimiento destinado a la prevención y/o al tratamiento de una infección vírica en un individuo, que comprende una administración de ARN, que codifica un antígeno vírico, contra el cual debe dirigirse la respuesta inmunológica, y una administración de ligando de Flt3.

13. Ligando de Flt3 para su utilización en un procedimiento destinado a la prevención y/o al tratamiento de una infección bacteriana en un individuo, que comprende una administración de ARN, que codifica un antígeno bacteriano, contra el cual debe dirigirse la respuesta inmunológica, y una administración de ligando de Flt3.

14. Ligando de Flt3 para su utilización en un procedimiento destinado a la prevención y/o al tratamiento de una alergia en un individuo, que comprende la administración de ARN, que codifica un alérgeno relevante para la alergia, y una administración de ligando de Flt3.

15. Ligando de Flt3 según una de las reivindicaciones 7 a 14, en el que el individuo es un ser humano.

16. Utilización de ligando de Flt3 para la preparación de una composición farmacéutica para incrementar la inmunogenicidad de una vacuna de ARN.