Métodos de generación y examen para polipéptidos quiméricos líticos.

Metodo de examen para un polipeptido quimerico litico que comprende las etapas de:

(a) proporcionar una o mas secuencias de ADN que codifican cada una al menos un dominio de union a celulas (CBD) y una o mas secuencias de ADN que codifican cada una al menos un dominio activo enzimatico (EAD) y opcionalmente una o mas secuencias de ADN que codifican cada una al menos un CBD y al menos un EAD, en el que el EAD se selecciona del grupo que consiste en

(i) el dominio litico de una lisina de bacteriofago,

(ii) el dominio litico de una bacteriocina,

(iii) el dominio litico de una autolisina bacteriana; y

(iv) una proteina asociada a cola de bacteriofago que tiene actividad litica;

(b) amplificar una secuencia de primer (1er) dominio seleccionada de las secuencias de dominio de (a) usando un par de cebadores disenados para introducir diferentes sitios de restriccion en el extremo 5' y en el extremo 3', y un marcaje con etiqueta en el extremo 5' o en el extremo 3';

(c) amplificar una secuencia de segundo (2o) dominio seleccionada de las secuencias de dominio de (a) usando un par de cebadores disenados para introducir:

(i) en el caso del marcaje del extremo 5' del 1er dominio: en el extremo 5' el mismo sitio de restriccion que en el extremo 3' del 1er dominio, y en el extremo 3' un sitio de restriccion diferente de los sitios de restriccion introducidos en la secuencia de 1er dominio,

(ii) en el caso del marcaje del extremo 3' del 1er dominio: en el extremo 3' el mismo sitio de restriccion que en el extremo 5' del 1er 20 dominio, y en el extremo 5' un sitio de restriccion diferente de los sitios de restriccion introducidos en la secuencia de 1er dominio;

(d) amplificar una secuencia de tercer (3er) dominio seleccionada de las secuencias de dominio de (a) usando un par de cebadores disenados para introducir:

(i) en el caso del marcaje del extremo 5' del 1er dominio: en el extremo 5' el mismo sitio de restriccion que en el extremo 3' del 2o dominio anterior, y en el extremo 3' un sitio de restriccion que es diferente al de en el extremo 5' del 1er dominio,

(ii) en el caso del marcaje del extremo 3' del 1er dominio: en el extremo 3' el mismo sitio de restriccion que en el extremo 5' del 2o dominio anterior, y en el extremo 5' un sitio de restriccion que es diferente al de en el extremo 3' del 1er dominio

en el que el par de cebadores se disena ademas de manera que los sitios de restriccion sean diferentes en el extremo 5' y en el extremo 3' de la secuencia de 3er dominio;

(e) opcionalmente amplificar una o mas secuencias de dominio adicionales seleccionadas de las secuencias de dominio de (a) para ampliar la serie de secuencias de dominio segun las etapas (b) a

(d), usando para cada una de dicha una o mas secuencias de dominio adicionales un par de cebadores disenados siguiendo el principio de las etapas (c) y (d) para introducir:

(i) en el caso del marcaje del extremo 5' del 1er dominio: en el extremo 5' el mismo sitio de restriccion que en el extremo 3' del dominio anterior, y en el extremo 3' un sitio de restriccion que es diferente al de en el extremo 5' del 1er dominio,

(ii) en el caso del marcaje del extremo 3' del 1er dominio: en el extremo 3' el mismo sitio de restriccion que en el extremo 5' del dominio anterior, y en el extremo 5' un sitio de restriccion que es diferente al de en el extremo 3' del 1er dominio;

en el que el par de cebadores se disena ademas de manera que los sitios de restriccion sean diferentes en el extremo 5' y en el extremo 3' de cada una de dicha una o mas secuencias de dominio adicionales;

(f) realizar una digestion de restriccion de las secuencias de dominio amplificadas de cualquiera de las etapas (b) a (e) con enzimas de restriccion que seleccionan como diana los sitios de restriccion introducidos en cualquiera de las etapas (b) a (e), en el que no se realiza una digestion de restriccion en el sitio de restriccion introducido en un extremo que porta un marcaje con etiqueta;

(g) ligar las secuencias de 1er y 2o dominio digeridas obtenidas en la etapa (f) para obtener un producto de ligacion que comprende las secuencias de 1er y 2o dominio;

(h) unir el producto de ligacion de la etapa (g) a un soporte solido usando el marcaje de etiqueta de la secuencia de 1er dominio para obtener un producto de ligacion unido que comprende las secuencias de 1er y 2o dominio;

(j) ligar la secuencia de 3er dominio digerida de (d) obtenida en la etapa (f) al producto de ligacion unido de la etapa (h) para obtener un producto de ligacion unido que comprende las secuencias de 1er, 2o y 3er dominio;

(k) ligar opcionalmente una o mas secuencias de dominio digeridas de (e) obtenidas en la etapa (f) al producto de ligacion unido de la etapa (j) para obtener un producto de ligacion unido que comprende una o mas secuencias de dominio adicionales de (e);

(l) liberar el producto de ligacion obtenido en cualquiera de las etapas (h) a (k) del soporte solido;

(m) clonar el producto de ligacion obtenido en la etapa (I) en un vector de expresion;

(n) introducir el vector obtenido en la etapa (m) en un hospedador de expresion, preferiblemente en un hospedador de expresion bacteriano;

(o) cultivar el hospedador de expresion de la etapa (n) que porta el vector obtenido en la etapa (m) en condiciones adecuadas para permitir la expresion de un polipeptido litico codificado por las secuencias de dominio del producto de ligacion clonado;

(p) seleccionar y aislar un clon de expresion que expresa un polipeptido litico segun la etapa (o) usando la actividad litica del polipeptido; y

(q) caracterizar el polipeptido litico expresado por el clon de expresion aislado de la etapa (p) e identificar un polipeptido quimerico litico.