PROCEDIMIENTO PARA EL ENRIQUECIMIENTO INESPECÍFICO DE CÉLULAS BACTERIANAS.

Procedimiento para el enriquecimiento inespecífico de células bacterianas La presente invención se refiere a un procedimiento para el enriquecimiento inespecífico de células bacterianas mediante polímeros catiónicos o aniónicos y soportes magnéticos. El punto de partida de casi cualquier procesamiento, análisis o aislamiento de componentes celulares es el enriquecimiento de las células, la cosecha de células. Ésta se realiza normalmente mediante centrifugación. Esta etapa de centrifugación plantea el problema principal en la automatización completa del procedimiento como la purificación de plásmidos ya que, además del alto gasto técnico para la integración de una centrífuga en un robot de procesamiento correspondiente, se necesita una precisión extremadamente alta en la posición de inicio y parada del proceso de centrifugación. Por tanto, los procedimientos automáticos del procesamiento, análisis o aislamiento de componentes celulares empiezan generalmente con células enriquecidas, separadas por centrifugación o sedimentadas ya fuera del robot de procesamiento. Sin embargo, por ejemplo, para un análisis rápido de genomas completos, proteomas, pero también para la rápida resolución de estructuras y funciones en procedimientos de alto rendimiento, es esencial una automatización lo más completa posible de los procedimiento relevantes a este respecto. A este respecto, la automatización de etapas parciales, por ejemplo, en el análisis del genoma, ya está muy avanzada: tanto el cultivo de bacterias como también el aislamiento de plásmidos pueden realizarse automáticamente. Sin embargo, hasta la fecha no ha podido realizarse una automatización sencilla, rentable y completa del procedimiento, incluida la cosecha de células. El procedimiento convencional de la cosecha de células es la separación por centrifugación de los cultivos bacterianos. Para esto se necesita una centrífuga de placas de microtitulación, especialmente en procedimientos que se diseñarán para un mayor rendimiento. Un procedimiento alternativo hace uso del enriquecimiento de las células cultivadas mediante membranas de filtración, véase, por ejemplo, el documento WO01/51206, 3M Innovative Properties Co (US) y el documento US5.464.541, Diagen Inst. f. Molekularbiologie; sin embargo, en suspensiones celulares altamente enriquecidas y la alta viscosidad de las disoluciones asociada a ellas, el procedimiento es muy propenso a fallar en los referente a obstrucciones. Lo mismo rige para la unión similar a intercambiador iónico a una matriz porosa, combinada con técnicas de filtración o vacío (documento WO92/07863, Qiagen). Esto puede presentar grandes problemas, especialmente para procedimientos automáticos. Un enriquecimiento de microorganismos mediante procedimientos basados en partículas magnéticas es en principio adecuado para la automatización. Hasta la fecha se describieron tres procedimientos de enriquecimiento para bacterias que, no obstante, presentan claras desventajas con respecto a la especificidad de cepas y a los costes de preparación. El documento EP 1 113676 A2, Chemagen AG, y el documento WO 01/53525 A2, Genpoint AS, describen un procedimiento para el enriquecimiento de microorganismos sobre una fase sólida mediante un ligando no específico que está inmovilizado covalentemente o no covalentemente sobre esta fase sólida. Fases sólidas en el sentido de este procedimiento son perlas de poli(alcohol vinílico) que pueden ser magnéticas o no magnéticas. Como ligandos se consideran en el sentido de este procedimiento moléculas que pueden servir de sustancias nutritivas para los microorganismos. La desventaja de este procedimiento consiste en que determinados ligandos deben inmovilizarse sobre un soporte, lo que conduce a una clara elevación de los costes de preparación. Otra desventaja consiste en que para distintas cepas deben inmovilizarse eventualmente distintos ligandos, por tanto las perlas magnéticas y el procedimiento no pueden usarse universalmente. En otra solicitud, concretamente en el documento WO98/51696, Genpoint, para el enriquecimiento de bacterias sobre partículas magnéticas se describen mezclas de sales, alcoholes y polímeros comparables a polietilenglicol o a polietilenglicol. El procedimiento descrito en el documento WO98/51693 necesita 5-20 minutos y adiciones de polímero del 2-50 % (peso/volumen). Estas altas concentraciones de sales o polímeros presentan problemas en el procesamiento de las bacterias ya que, por ejemplo, el polietilenglicol al 30 % es muy pastoso, o altas concentraciones de sales interfieren en la electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida. El documento WO00/29562, Merck Patent GmbH, describe un procedimiento para aislar ADN de plásmido de microorganismos mediante a) acidificación del cultivo de microorganismos, incubación y mezcla con los materiales en fase sólida (partículas magnéticas de sílice) y b) posterior purificación de plásmidos. Sin embargo, este procedimiento no puede realizarse para todas las cepas de E. coli sin pérdidas de rendimiento en parte drásticas. Otra desventaja de este procedimiento consiste en la cantidad de perlas necesarias, ya que los costes de perlas constituyen un aspecto clave de los costes de enriquecimiento de bacterias y especialmente las perlas de sílice son relativamente caras. Como las perlas de sílice también pueden unirse en principio al ADN, también pueden 2 ES 2 367 478 T3 observarse pérdidas de rendimiento en el aislamiento de plásmidos con perlas de sílice. El documento WO91/12079, Amersham, describe un procedimiento para la precipitación de células sobre perlas magnéticas que se unen inespecíficamente a los polímeros (células). En este procedimiento debe mantenerse forzosamente el orden de adición de los agentes necesarios (alcohol y sal) y de las perlas magnéticas. No es posible una mezcla previa de los agentes y/o agentes y perlas y, por tanto, no pueden ahorrarse etapas de pipeteado, lo que puede ser necesario en una automatización para el aprovechamiento óptimo de un robot. Además, las partículas magnéticas que pueden usarse se limitan a partículas de celulosa/óxido de hierro. El documento US 6.284.470 B1, Promega, describe la formación de complejos de células intactas con perlas magnéticas. El procedimiento está limitado a partículas de sílice en lo que respecta a las partículas magnéticas que pueden usarse. Pero como este procedimiento prescribe que un volumen de alcohol debe añadirse a un volumen de suspensión celular, este procedimiento apenas puede aplicarse sin claras pérdidas de rendimiento para la cosecha de células en placas de pocillos profundos. Además, altas concentraciones de alcohol pueden conducir a una precipitación de las proteínas. Una serie de estudios ha mostrado que los polímeros catiónicos pueden interaccionar con bacterias. Los experimentos han dado como resultado, por ejemplo, que polímeros catiónicos como, por ejemplo, quitosano (quitosano es quitina desacetilada) son muy adecuados para encapsular o sellar células microbianas vivas para experimentos individuales (véase por ejemplo, Methods Enzymol. 1987, vol. 135, 259-268, o el documento US5.489.401). El quitosano también se usa para el encapsulamiento de biomateriales activos en polímeros de perlas (documentos US 4.647.536 y WO01/46266). El quitosano también se usa, dado el caso también en forma modificada, como recubrimiento de artículos o kits de ensayo para inmunoensayos (documento US5.208.166). Sin embargo, las publicaciones referentes a la influencia de polímeros catiónicos sobre la hidrofobia de paredes celulares microbianas había mostrado que aunque la adhesión sobre superficies hidrófobas a valores de pH por encima de 3 aumentó claramente, a valores de pH inferiores a 3 disminuyó a casi el 0 % (Ref.: Goldberg, S., Doile, R. J. y Rosenberg, M., 1990, J. Bacteriol., vol. 172, 5650-5654). Además, el uso de un procedimiento soportado sobre partículas magnéticas todavía ofrece más ventajas, ya que se hace posible una cosecha separada de pocillos individuales, por ejemplo, de una placa de pocillos profundos y no debe cosecharse completamente toda la placa. Por tanto, por ejemplo, en el marco de estudios de expresión, pueden cosecharse en función del tiempo. En resumen, puede constatarse que no hay disponible un procedimiento sencillo para el enriquecimiento eficiente, rápido y rentable de células bacterianas que prescinda de una etapa de centrifugación y que al mismo tiempo pueda usarse para un amplio espectro de bacterias. Por tanto, el objetivo de la invención consiste en proporcionar un procedimiento para el enriquecimiento inespecífico de células bacterianas que prescinda de la etapa de centrifugación. El objetivo se alcanza mediante el objeto definido en las reivindicaciones. La invención se explica más detalladamente mediante las siguientes... [Seguir leyendo]

1.- Procedimiento para la purificación inespecífica de bacterias que comprende las siguientes etapas: a) Poner en contacto una muestra que contiene células bacterianas con un polímero catiónico a un valor de pH ácido, formándose una red de bacterias y polímeros 5 b) Añadir partículas magnéticas, depositándose las partículas magnéticas en la red de bacterias y polímeros c) Separar las bacterias de la muestra mediante las partículas magnéticas depositadas en la red. 2.- Procedimiento según la reivindicación 1, en el que después de la etapa a) y/o la etapa b) se introduce una etapa de incubación. 3.- Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, en el que el polímero catiónico es quitosano o 10 polilisina. 4.- Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, en el que se añade quitosano con una concentración en el intervalo de 0,05 a 100 µg/ml de cultivo y polilisina con una concentración en el intervalo de 12,5 a 150 µg/ml de cultivo. 5.- Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, en el que el valor de pH se ajusta con HCl/HAc a 15 menos de o igual a 3 o con ácido fórmico a menos de o igual a 4. 6.- Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, en el que las partículas magnéticas tienen un diámetro de 0,5 a 5 µm. 7.- Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, en el que las partículas magnéticas son un pigmento magnético o una perla de poliestireno magnética, especialmente con una superficie de NH 2, COOH u OH. 20 8.- Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, en el que las bacterias purificadas son E. coli, Bacillus spec, Proteus spec, Micrococcus spec, Staphylococcus spec o Citrobacter spec. 11 Sílice ES 2 367 478 T3 12 ES 2 367 478 T3 13 ES 2 367 478 T3 14 ES 2 367 478 T3 3,00 2,50 2,00 1,50 1,00 0,50 ES 2 367 478 T3 0,00 0,0 2,0 4,0 6,0 8,0 10,0 12,0 16 ES 2 367 478 T3 17