PROCEDIMIENTO PARA LA DETECCION DE ENDOTOXINAS.

Procedimiento para la detección de endotoxinas que comprende las etapas de:

a) la puesta en contacto de una muestra que contiene endotoxinas con una superficie recubierta con una sustancia de unión a endotoxina, a continuación

b) la incubación de proteínas de cola de bacteriófago o proteínas de cabeza de bacteriófago de bacteriófagos con cola o de proteínas de cubierta de bacteriófago de bacteriófagos sin cola en endotoxinas inmovilizadas sobre la superficie, y

c) la detección de proteínas de cola de bacteriófago o proteínas de cabeza de bacteriófago de bacteriófagos con cola o de proteínas de cubierta de bacteriófago de bacteriófagos sin cola mediante procedimientos espectroscópicos, ELISA, reacciones de detección química o enzimática de endotoxinas o componentes escindidos de endotoxinas o mediante medida de la capacidad

Procedimiento para la detección de endotoxinas.

La presente invención se refiere a procedimientos para la detección de endotoxinas en una muestra.

Endotoxina (ET) designa una familia de lipopolisacáridos que, junto con proteínas y fosfolípidos, forman la pared celular externa de bacterias gramnegativas. Las endotoxinas aparecen exclusivamente en este grupo de bacterias y desempeñan un papel importante en la organización, estabilidad y función de barrera de la membrana externa. Numerosos bacteriófagos aprovechan las endotoxinas o lipopolisacáridos generales para el reconocimiento específico de sus bacterias hospedadoras.

Todas las variantes de endotoxina están compuestas por un heteropolisacárido que está unido covalentemente a lípido A. El lípido A ancla la endotoxina en la membrana bacteriana externa. El heteropolisacárido, que está compuesto por un oligosacárido central y el antígeno O, se muestra en la disolución circundante y determina la identidad serológica de la bacteria. El antígeno O está compuesto por unidades oligosacáridas repetidas cuya composición es específica de cepa. Los constituyentes característicos del oligosacárido central son ácido 2-ceto-3-desoxioctulosónico (KDO) y L-glicero-D-manoheptosa (Hep).

La parte más conservada de la endotoxina de distintos géneros es el lípido A. Está igualmente conservada que el lípido A la región central interna, la región central externa presenta ya una mayor variación. La región central interna, el KDO y el lípido A portan por sí mismos varios grupos fosfato como sustituyentes y son por tanto responsables de la carga negativa de la endotoxina. Además, los grupos fosfato en el lípido A y la región central pueden estar sustituidos variablemente con arabinosa, etanolamina y fosfato. Los constituyentes sacáridos individuales del antígeno O están acetilados, sializados o glucosilados. El antígeno O varía además respecto al número de unidades repetidas, por lo que la población de endotoxinas de cada bacteria presenta cierta heterogeneidad.

Las endotoxinas son biomoléculas que, sin las correspondientes medidas de precaución, se encuentran prácticamente en todas las disoluciones acuosas. Las endotoxinas pueden conducir en hombres y animales a sepsis, una fuerte reacción adversa del sistema inmunitario. Por tanto, por ejemplo en la preparación de proteínas farmacológicas, han de detectarse exactamente las impurezas con endotoxina y a continuación eliminarse completamente. Las endotoxinas representan un problema en medicamentos preparados por ingeniería genética, productos terapéuticos genéticos o sustancias que se inyectan en hombres o animales (por ejemplo, tratamiento veterinario o en ensayos animales). Sin embargo, no sólo en aplicaciones médicas, sino también en investigación como en experimentos de transfección de células de mamífero, puede observarse una inhibición o una reducción de la eficacia de transfección por endotoxinas.

Para poder utilizar proteínas en el marco de estudios clínicos, las farmacopeas europea y estadounidense requieren que las proteínas no superen determinados valores límite de carga de endotoxina (por ejemplo, inmunoglobulina sérica = 0,91 UE/ml, esto corresponde a = 5 UE/kg de peso corporal y hora (dosis = UE/kg•h); UE = unidad de endotoxina; "FDA (Food and Drug Administration): Guideline on Validation of LAL as End Product)". En caso de que un medicamento o las proteínas en él contenidas presenten una carga alta de endotoxinas, ésta puede conducir a la muerte del sujeto de ensayo. La defensa inmunitaria mal dirigida daña al paciente por una sobrerreacción. Esto puede conducir a inflamaciones de tejido, caída de la presión sanguínea, taquicardia, trombosis, choque, etc. Ya una exposición de larga duración a endotoxinas en cantidades de picogramos puede conducir a efectos secundarios crónicos como, por ejemplo, inmunodeficiencias, síntomas sépticos, etc. Por tanto, en el marco de la preparación de sustancias, particularmente generadas en procesos en condiciones de "Good Manufacturing Practice (Buenas Prácticas de Fabricación) (GMP)", las endotoxinas se empobrecen lo más posible. Sin embargo, la eliminación de endotoxinas en proteínas, polisacáridos y ADN es problemática. Precisamente en proteínas, hay grandes problemas por sus propiedades intrínsecas como estado de carga o hidrofobicidad, que pueden impedir casi la eliminación de endotoxinas o conducir a grandes pérdidas de producto en el procedimiento de eliminación.

Actualmente, se han descrito cuatro procedimientos para la detección de endotoxina en disoluciones biológicos, en los que sólo los dos primeros están admitidos por la FDA. 1. "Ensayo de pirógenos en conejos": Un procedimiento en el que se inyecta a un conejo vivo una disolución de endotoxina y se desencadena por tanto una reacción inmunitaria. Esta respuesta inmunitaria causada por endotoxina se detecta mediante el desarrollo de fiebre. 2. Es claramente mejor estandarizable el ensayo de "Lisado de amebocitos de Limulus (LAL)", que actualmente es el ensayo más frecuentemente usado (BioWhittaker, Inc., Charles River, Inc., Associates of Cape Cod, Inc., todos los EE.UU.). En este procedimiento, se mide la aglutinación de la sangre de cangrejo de herradura (Limulus polyphemus) después de contacto con endotoxina. 3. El ensayo de pirógenos in vitro basado en la detección de interleucina 1ß en sangre humana, que participa en la inducción de fiebre. El ensayo está compuesto por una etapa de incubación de sangre humana con la disolución a analizar y la posterior detección de la interleucina mediante anticuerpos. 4. Es una posibilidad adicional el empleo de un sistema de cultivo celular especial (Sterogene Inc., EE.UU.) con el que sigue la activación de monocitos mediante la generación de determinadas citocinas.

Los dos procedimientos citados en primer lugar son sin embargo muy caros y cuestionables no por último por razones de protección de animales por la gran necesidad de animales de ensayo o de sangre de los muy escasos cangrejos de herradura. El ensayo LAL puede ciertamente miniaturizarse y automatizarse también, pero debido a la baja estabilidad de los componentes tiene enormes desventajas en su aplicación. Una disolución de LAL una vez abierta debe procesarse directamente y aplicarse, ya que los componentes agregan al cabo de pocas horas. El ensayo de pirógenos in vitro requiere sangre humana lo más fresca posible y es relativamente largo, ya que la producción de la interleucina requiere de aproximadamente 10 a 24 horas. Además de endotoxinas, pueden reconocerse con el ensayo de pirógenos también otros pirógenos. Este ensayo se usa sin embargo en primera línea como sustitución del "ensayo de pirógenos en conejos". Para todos los procedimientos de ensayo es necesario personal entrenado y los procedimientos son muy sensibles a interferencias porque, por ejemplo, el sistema inmunitario de los conejos puede reaccionar de forma completamente distinta a la misma dosis de endotoxina. El procedimiento de cultivo celular de la compañía Sterogene es igualmente muy costoso, como todos los procedimientos de cultivo celular, y presenta problemas de estandarización.

En conjunto, puede comprobarse que no hay un procedimiento sencillo, manejable y económico para la detección de endotoxina y que los procedimientos utilizados actualmente presentan una serie de desventajas. Existe por tanto la necesidad de un procedimiento que evite estas desventajas.

Por tanto, la invención se basa en el objetivo de procurar un procedimiento que pueda detectar endotoxinas más rápidamente, más sencillamente y de forma más estandarizada en disoluciones y muestras.

Los objetivos se consiguen mediante el objeto definido en las reivindicaciones.

Las siguientes figuras ilustran la invención.

La Fig. 1 muestra una vista esquemática de la estructura química de la endotoxina de E. coli 0111:B4. Hep = L-glicero-D-manoheptosa; Gal = galactosa; Glc = glucosa; KDO = ácido 2-ceto-3-desoxioctulosónico; NGa = N-acetilgalactosamina; NGc = N-acetilglucosamina.

La Figura 2 muestra los resultados de medidas de resonancia de plasmón de superficie. (A) Curvas de resonancia que se han medido como respuesta a la inyección de distintas concentraciones de p12 (cada una en µg/ml: 100; 25; 6,25; 4; 1,56; 0,4) (_). La unión se realiza en la endotoxina de E. coli D21f1, que se ha inmovilizado sobre un chip de HPA hidrófobo. Se marca la inyección de p12 y EDTA (5 mM) mediante una barra sobre las curvas. Tampón: Tris 20 mM, NaCl 150 mM, pH 8,0. (B)...

1. Procedimiento para la detección de endotoxinas que comprende las etapas de:

a) la puesta en contacto de una muestra que contiene endotoxinas con una superficie recubierta con una sustancia de unión a endotoxina, a continuación

b) la incubación de proteínas de cola de bacteriófago o proteínas de cabeza de bacteriófago de bacteriófagos con cola o de proteínas de cubierta de bacteriófago de bacteriófagos sin cola en endotoxinas inmovilizadas sobre la superficie, y

c) la detección de proteínas de cola de bacteriófago o proteínas de cabeza de bacteriófago de bacteriófagos con cola o de proteínas de cubierta de bacteriófago de bacteriófagos sin cola mediante procedimientos espectroscópicos, ELISA, reacciones de detección química o enzimática de endotoxinas o componentes escindidos de endotoxinas o mediante medida de la capacidad.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, que comprende además después de la etapa b) y antes de la etapa c) la etapa adicional de

b') separación de proteínas de cola de bacteriófago o proteínas de cabeza de bacteriófago de bacteriófagos con cola o de proteínas de cubierta de bacteriófago de bacteriófagos sin cola de la endotoxina.

3. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la sustancia de unión a endotoxina es una proteína de cola de bacteriófago o proteína de cabeza de bacteriófago de bacteriófagos con cola o una proteína de cubierta de bacteriófago de bacteriófagos sin cola.

4. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, en el que la proteína de cola de bacteriófago es una proteína de fibra de cola de bacteriófago corta.

5. Procedimiento según la reivindicación 4, en el que la proteína de fibra de cola de bacteriófago corta se selecciona de K3, T2, T4, Ox2, RB32-33, AR1, PP01 y RB69.

6. Procedimiento según la reivindicación 4 ó 5, en el que la proteína de cola de bacteriófago presenta una homología a nivel de aminoácidos de al menos un 60% con la proteína T4p12.

7. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, en el que las proteínas de cola de bacteriófago o proteínas de cabeza de bacteriófago de bacteriófagos con cola o las proteínas de cubierta de bacteriófago de bacteriófagos sin cola están modificadas.

8. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, en el que las proteínas de cola de bacteriófago o las proteínas de cabeza de bacteriófago de bacteriófagos con cola o las proteínas de cubierta de bacteriófago de bacteriófagos sin cola están unidas covalentemente con proteínas activas enzimáticas.

9. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, en el que la proteína de cola de bacteriófago o proteína de cabeza de bacteriófago de bacteriófagos con cola o la proteína de cubierta de bacteriófago de bacteriófagos sin cola presentan un marcador Strep o un marcador His.

10. Procedimiento según la reivindicación 9, en el que el marcador presenta una secuencia de aminoácidos según las SEC ID NO. 5, 6 ó 7.

11. Procedimiento según la reivindicación 9 ó 10, en el que se usa como proteína de cola de bacteriófago la proteína p12 de los fagos T4, K3, T2, Ox2, RB32-33, AR1, PP01 o RB69.

12. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, en el que la concentración de Ca²⁺ en la incubación asciende a 0,1 µM a 10 mM y/o la concentración de Mg²⁺ a 0,1 µM a 10 mM.

13. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, en el que la endotoxina marcada se desplaza por la unión con una proteína de cola de bacteriófago o proteína de cabeza de bacteriófago de bacteriófagos con cola o una proteína de cubierta de bacteriófago de bacteriófagos sin cola y a continuación se detecta la endotoxina marcada.

14. Un kit de detección de endotoxina que comprende un portador recubierto con sustancia de unión a endotoxina, un recipiente que contiene una endotoxina de referencia para la medida de una curva patrón y un recipiente con al menos una proteína de cola de bacteriófago o proteína de cabeza de bacteriófago de bacteriófagos con cola o una proteína de cubierta de bacteriófago de bacteriófagos sin cola, o un anticuerpo anti-lípido A.