Procedimiento de selección para ácidos nucleicos internalizantes en células.

Un procedimiento para seleccionar moléculas que contienen ARN internalizables que comprende:

a) poner en contacto una o más células con una colección de ácidos nucleicos aleatorios de moléculas quecontienen ARN, comprendiendo las moléculas que contienen ARN ácidos nucleicos estabilizados y conteniendoregiones de secuencia constante;

b) lavar las células;

c) exponer las células a una o más nucleasas, en las que la una o más nucleasas son ARNasas o ribonucleasas;

d) extraer los ácidos ribonucleicos totales de las células;

e) multiplicar los ácidos ribonucleicos internalizados; y

f) repetir las etapas de selección a) - e).

Procedimiento de selección para ácidos nucleicos internalizantes en células.

Campo de la invención [0001] La presente invención se refiere en general a los campos de la biología molecular y la bioquímica. Más específicamente, la invención se refiere a la orientación de ácidos nucleicos y a procedimientos, composiciones y kits para la selección y suministro de moléculas que contienen ARN.

Antecedentes de la invención [0002] Actualmente, el suministro de agentes a células requiere mecanismos de suministro coordinados que a menudo son tóxicos, ineficaces o altamente inespecíficos. Además, muchos agentes suministrados a células son tóxicos y requieren una internalización específica y rápida en la célula apropiada para evitar una toxicidad indeseada para el organismo.

Hicke BJ y col.: "Tenascin-C aptamers are generated using tumor cells and purified protein", Journal of Biological Chemistr y , American Society for Biochemistr y and Molecular Biology, Inc, EE.UU., vol. 276, nº 52, 28 de diciembre de 2001, dan a conocer un procedimiento Selex para identificar un aptámero para el ensayo de un ligando selectivo de tumor.

El documento WO 2005/111238 A2 (Archemix Corp [EE.UU.]; Epstein David [EE.UU.]; Pendergrast Shannon [EE.UU.]; Keef) , 24 de noviembre de 2005, da a conocer un procedimiento de modulación del suministro intracelular de agentes terapéuticos usando aptámeros.

El documento WO 2006/096754 A2 (Archemix Corp [EE.UU.]; Diener John L [EE.UU.]; Hatala Paul [EE.UU.]; Killough Jas) da a conocer un procedimiento Selex para generar aptámeros para uso como productos terapéuticos de cáncer de próstata.

Cerchia Laura y col.: "Neutralizing aptamers from whole-cell SELEX inhibit the RET receptor tyrosine kinase.", Plos Biology, abril de 2005 LNKD-PUBMED: 15769183, vol. 3, nº 4, abril de 2005, dan a conocer un procedimiento Selex para generar aptámeros resistentes a nucleasa.

Shangguan Dihua y col.: "Aptamers evolved from live cells as effective molecular probes for cancer study", Proceedings Of The National Academy Of Sciences Of The United States Of America, vol. 103, nº 32, agosto de 2006, dan a conocer un grupo de aptámeros que reconocen específicamente células de leucemia.

Ulrich Henning y col.: "In vitro Selection of RNA Aptamers That Bind to Cell Adhesion Receptors of Tr y panosoma cruzi and Inhibit Cell Invasion", Journal of Biological Chemistr y , American Society for Biochemistr y and Molecular Biology, Inc, EE.UU., vol. 277 nº 23, 7 de junio de 2002, dan a conocer un procedimiento Selex para la generación de aptámeros con afinidad por receptores de parásitos.

Sumario de la invención [0009] Existe la necesidad de identificación y selección de compuestos que puedan suministrar agentes a células con toxicidad y efectos inespecíficos reducidos sobre el organismo. Además, existe la necesidad de procedimientos de selección de compuestos que puedan internalizar rápidamente agentes en un tejido, célula o grupo de células predeterminado.

Al analizar los mecanismos de internalización celular, se ha descubierto que ciertas clases de moléculas pueden suministrar cargas moleculares a la célula. Este descubrimiento se ha explotado para proporcionar un procedimiento para seleccionar moléculas que contienen ARN internalizables como se define en las reivindicación. Según algunos aspectos, ciertos procedimientos permiten también la identificación de las moléculas internalizadas más rápidamente.

Se proporciona un procedimiento para la selección de moléculas que contienen ARN internalizables. El procedimiento supone poner en contacto una o más células (por ejemplo, células eucarióticas) o procarióticas con una colección aleatoria de moléculas que contienen ARN que comprende ácidos nucleicos estabilizados y que contiene regiones de secuencia constante. Las células que se ponen en contacto con la colección aleatoria se lavan y se exponen a una o más nucleasas, que son ARNasas o ribonucleasas. Se extrae el ARN total de las células y se multiplican los ácidos ribonucleicos internalizados. Se repite entonces el procedimiento. En algunas realizaciones, se repite el procedimiento de selección usando moléculas que contienen ARN identificadas en una ronda de selección. En otras realizaciones, se selecciona una molécula que contiene ARN internalizable usando dos o más rondas del procedimiento de selección. En ciertas realizaciones, se selecciona una molécula que contiene ARN internalizada usando al menos diez rondas del procedimiento de selección. En ciertas realizaciones, se ponen en contacto una o más células con las moléculas que contienen ARN para reducir el periodo de tiempo de cada ronda posterior de selección. En realizaciones particulares, se ponen en contacto una o más células con las moléculas que contienen ARN internalizables durante menos de 24 horas, o menos de 10 horas, o menos de 5 horas, o menos de 2 horas, menos de 1 hora, menos de 30 minutos, menos de 20 minutos, menos de 10 minutos, menos de 2 minutos, menos de 1 minuto o menos de 30 segundos.

En realizaciones muy particulares, el procedimiento comprende aislar moléculas que contienen ARN internalizables mediante múltiples rondas de selección en que cada ronda posterior de selección implica exponer la molécula que contiene ARN internalizable de una ronda anterior de selección a las células durante un periodo de tiempo reducido en comparación con la ronda de selección anterior. Por ejemplo, la primera ronda de selección puede incluir exponer las moléculas que contienen ARN internalizables a las células durante 10 horas, la segunda ronda puede suponer exponer las moléculas que contienen ARN seleccionadas de la primera ronda a las células durante 5 horas, y exponer entonces las moléculas que contienen ARN seleccionadas en la segunda ronda a las células durante 2 horas y así en adelante. Dicho procedimiento identifica a aquellos compuestos que se internalizan más rápidamente en una célula de interés.

En otras realizaciones, la colección contiene ARN funcional de un conjunto de secuencias aleatorizadas. En ciertas realizaciones, cada ARN comprende al menos una secuencia aleatoria y al menos una secuencia constante. En realizaciones más particulares, los ARN comprenden dos o más secuencias constantes.

En más realizaciones, la secuencia aleatoria comprende al menos 10 nucleótidos, al menos 20 nucleótidos, al menos 30 nucleótidos, al menos 40 nucleótidos, al menos 50 nucleótidos, al menos 60 nucleótidos, al menos 70 nucleótidos, al menos 80 nucleótidos, al menos 90 nucleótidos o más de 100 nucleótidos.

Los ARN estabilizados pueden ser conjuntos de ARN modificados con 2’-fluoro.

El procedimiento puede comprender la etapa de determinar la secuencia de los ácidos nucleicos internalizados. Esta etapa puede comprender secuenciación directa, reacción en cadena de la polimerasatranscriptasa inversa, unión a una matriz, espectrometría de masas y combinaciones de las mismas.

En realizaciones particulares, las nucleasas incluyen ARNasa A, ARNasa B, ARNasa C, ARNasa 1, ARNasa T1, ARNasa T2, ARNasa L, ARNasa H, ARNasa de angiogenina, ARNasa eosinofílica, nucleasa microcócica, ribonucleasa 1 de mamífero, ribonucleasa 2, ribonucleasa de ARN mensajero, 5’-3’ exorribonucleasa, 3’-5’ exorribonucleasa, una enzima de eliminación de caperuza, desadenilasa, ARNasa P, ARNasa III, ARNasa B, ARNasa I, I*, ARNasa HI, ARNasa HII, ARNasa M, ARNasa R, ARNasa IV, F; ARNasa P2, 0, PIV, PC, ARNasa N, ARNasa II, PNPasa, ARNasa D, ARNasa BN, ARNasa T, ARNasa PH, oligoARNasa, ARNasa R, ARNasa Sa, ARNasa F1, ARNasa U2, ARNasa Ms o ARNasa St y combinaciones de las mismas o cócteles de nucleasas comercialmente disponibles. En otra realización, la nucleasa es ADNasa I, ADNasa IIa o ADNasa IIº.

En ciertas realizaciones, las moléculas que contienen ARN se seleccionan para internalización en células que expresan el receptor CD4 (por ejemplo, HeLa) . En otras realizaciones, se ligan las moléculas que contienen ARN seleccionadas con ARNip, toxinas, miARN, aptámeros o moléculas pequeñas para suministro a células que expresan CD4, tales como células HeLa.

En ciertos aspectos, se ha desarrollado un esquema de selección de ARN capaz de internalizarse en células sin la ayuda de mecanismos de transfección o suministro convencionales (por ejemplo, liposomas catiónicos, electroporación, reactivos de transfección, etc.) . Este esquema puede adaptarse para producir ARN que se internalizan en células específicas, en diferentes estados de células o en células en general. Las moléculas que contienen ARN pueden seleccionarse para portar una variedad de diferentes cargas para aplicaciones... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para seleccionar moléculas que contienen ARN internalizables que comprende:

a) poner en contacto una o más células con una colección de ácidos nucleicos aleatorios de moléculas que contienen ARN, comprendiendo las moléculas que contienen ARN ácidos nucleicos estabilizados y conteniendo regiones de secuencia constante;

b) lavar las células;

c) exponer las células a una o más nucleasas, en las que la una o más nucleasas son ARNasas o ribonucleasas;

d) extraer los ácidos ribonucleicos totales de las células;

e) multiplicar los ácidos ribonucleicos internalizados; y

f) repetir las etapas de selección a) - e) .

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que se repite el procedimiento de selección usando las moléculas que contienen ARN identificadas en la ronda 1 de selección.

3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que se selecciona una molécula que contiene ARN internalizable usando dos o más rondas del procedimiento de selección.

4. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que las una o más células se ponen en contacto con las moléculas que contienen ARN durante periodos decrecientes de tiempo en cada ronda posterior de selección.

5. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la una o más células se ponen en contacto con las moléculas que contienen ARN internalizables durante menos de 24 horas, menos de 10 horas, menos de 5 horas, menos de 2 horas, menos de 1 hora, menos de 30 minutos, menos de 20 minutos, menos de 10 minutos, menos de 5 minutos, menos de 2 minutos, menos de 1 minuto o menos de 30 segundos.

6. El procedimiento de la reivindicación 1, que comprende adicionalmente aislar moléculas que contienen ARN internalizables mediante múltiples rondas de selección, en que cada ronda posterior de selección implica exponer la molécula que contiene ARN internalizable de una ronda anterior de selección a las células durante un periodo reducido de tiempo en comparación con la ronda anterior de selección.

7. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la colección contiene ARN funcionales de un conjunto de secuencias aleatorizadas.

8. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el ARN comprende al menos una secuencia aleatoria y al menos una secuencia constante.

9. El procedimiento de la reivindicación 4, en el que la una o más células se ponen en contacto con menos entrada de moléculas que contienen ARN en cada ronda posterior de selección.

10. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que las moléculas que contienen ARN se seleccionan para internalización en células que expresan el receptor CD4.

11. El procedimiento de la reivindicación 10, en el que las moléculas que contienen ARN están ligadas con ARNip, toxinas, miARN, aptámeros o moléculas pequeñas.

12. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que las moléculas que contienen ARN son al menos parcialmente resistentes a nucleasa.

13. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el ARN comprende dos o más secuencias constantes.

14. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la secuencia aleatoria comprende al menos 10 nucleótidos, al menos 20 nucleótidos, al menos 30 nucleótidos, al menos 40 nucleótidos, al menos 50 nucleótidos, al menos 60 nucleótidos, al menos 70 nucleótidos, al menos 80 nucleótidos, al menos 90 nucleótidos o más de 100 nucleótidos.

15. El procedimiento de la reivindicación1, que comprende adicionalmente la etapa de tratar las células para evitar la endocitosis activa.

16. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que las moléculas que contienen ARN están marcadas detectablemente.

17. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que las células se fijan antes del contacto con la colección de moléculas que contienen ARN.