Uso de anticuerpos frente a la enzima SOD-3 para la inhibición del proceso de la angiogénesis y aplicaciones de dichos anticuerpos y de dicha enzima SOD-3.

Uso de anticuerpos frente a la enzima SOD-3 para la inhibición del proceso de la angiogénesis y aplicaciones de dichos anticuerpos y de dicha enzima SOD-3.

La presente invención se refiere al uso de la enzima SOD-3 como nueva diana molecular en prevención, terapia y/o tratamiento de patologías que cursan con angiogénesis, como por ejemplo degeneración macular asociada a la edad, artritis reumatoide o psoriasis; así como al uso en prevención, terapia y/o tratamiento de dichas patologías de anticuerpos que se unen, reaccionan o reconocen específicamente a SOD-3, y que modulan, preferentemente que inhiben, la actividad de dicha enzima, particularmente la actividad de SOD-3 humana.

formación de los vasos sanguíneos (Ushio-Fukai, Cardiovascular Res. 71 :226-235, 2006) . El efecto del H202 no se ciñe exclusivamente a la activación del VEGF-A, sino que, entre otros de sus múltiples efectos, provoca la activación del gen supresor tumoral PTEN (Connor et al.

1. Biol. Chem. 280: 16916-16924, 2005) manteniendo activa todas las rutas de señalización que discurren a través de AKT. A ello, hay que añadir que el H20 2 favorece la unión de NFK~ al DNA promoviendo la expresión de diversos genes, entre ellos el gen codificante para la interleucina 8 (IL-8) , el cual es esencial para la formación de estructuras tubulares en células endoteliales (Shono et al. Mol. Cell Biol. 16: 4231-4239, 1996) .

Dada la relevancia que se le atribuye a las moléculas ROS, muchas investigaciones se han orientado a dilucidar los mecanismos moleculares de las patologías asociadas a dichas moléculas, en particular, los estudios han sido dirigidos hacia las enzimas que median en el metabolismo redox. Una familia de proteínas que pertenecen al conjunto del metabolismo redox es la familia de la superóxido dismutasa (SOD) constituida por tres isoformas; una isforma citosólica denominada SOD-1, que es un homodímero que contiene cobre y zinc en su centro catalítico; una isforma mitocondrial denominada SOD-2, siendo un tetrámero que contienen manganeso; y una isoforma extracelular denominada SOD-3 o ec-SOD, la cual es un homotetrámero que contiene cobre y zinc (Zelko et al. Free Radical Biology & Medicine,

33: 337-349, 2002) . A pesar que SOD-1 y SOD-3 son isoformas y ambas contienen en su centro catalítico átomos de cobre y zinc, se consideran proteínas distintas tanto por su secuencia aminoacídica, sus propiedades antigénicas y por su distribución diferencial, tanto en los tejidos (http://omim.org/entr y /185490?search=sod3&highlight=sod3) como en la compartimentación celular. Esta familia de proteínas se caracteriza por mediar la reducción de aniones superóxido (02-) a oxígeno molecular (02) y peróxido de hidrógeno (H20 2) , disminuyendo así el efecto oxidante del 02-sobre los múltiples componentes celulares manteniendo la integridad celular. Anecdóticamente, uno de los productos de esta reacción, como es el H202, al hallarse en altos niveles es responsable de la promoción del proceso tumoral y del proceso angiogénico. Por ello, las enzimas relacionadas con el metabolismo del oxígeno han pasado a formar parte de las dianas terapéuticas para el tratamiento de diversas patologías.

Judah Folkman propuso a principios de la década de 1970 una teoría en la que argumentaba que el crecimiento tumoral es dependiente de angiogénesis tras alcanzar cierto tamaño, ya que necesita el aporte de nutrientes procedentes de la sangre para continuar su crecimiento (Folkman, 1. Med. 285: 1182-1186, 1971) Desde el momento en el que se estableció una estrecha relación entre el tumor y la angiogénesis, las terapias antiangiogénicas han sido objeto de gran interés para evitar el crecimiento y la diseminación de células tumorales a otros órganos o tejidos (Feron, Radiotherapy & Oncology, 92: 329-333, 2009) . Por ello, la inhibición de la angiogénesis presenta gran interés desde el punto de vista farmacológico, utilizando las distintas etapas de la angiogénesis (degradación de la matriz extracelular, migración, proliferación, evasión de la apoptosis y diferenciación de los nuevos vasos) como puntos esenciales para interferir e inhibir el proceso. En base a ello, se están explorando diversas vías de actuación para inhibir la creación de nuevos vasos. Reflejo de ello, son las diferentes estrategias utilizadas para desarrollar estrategias con potencial antiangiogénico, como es el uso de anticuerpos monoclonales dirigidos frente a factores angiogénicos libres en circulación, el uso de anticuerpos frente a receptores angiogénicos ubicados sobre las células endoteliales y el uso de inhibidores tirosín quinasas para impedir la activación celular (Kerenidi & Syrigos, Angiogenesis and Therapeutic targets in cancer. Bentham Science Publishers p. 1-34) .

A pesar de las múltiples dianas potenciales que presenta el proceso angiogénico, la terapia antiangiogénica actualmente usada en clínica se basa esencialmente en la inhibición del efecto del VEGF-A, bien sea mediante el bloqueo de su unión a sus receptores por el uso de anticuerpos, o por la administración de moléculas pequeñas que interfieren en la ruta de señalización del receptor VEGFR-2. En relación a la búsqueda de nuevas dianas moleculares en el proceso angiogénico, se han identificado varios inhibidores específicos para SOD-l, como es el caso del "disuljiram" (Marikovsky et al. Int. 1. Cancer, 97: 34-41, 2002) Y el "tetrathiomolybdate" (Doñate et al. Br. J. Cancer, 98: 776-783, 2008) .

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

Es un objetivo de la presente divulgación proporCIOnar una nueva diana molecular y tratamientos terapéuticos para inhibir toda patología que curse con promoción de angiogénesis.

La presente invención se refiere al uso de una nueva diana molecular involucrada estrechamente en el proceso angiogénico, como es SOD-3, y en el uso de anticuerpos específicos frente a dicha diana como terapia para enfermedades que cursen con angiogénesis no deseada o excesiva.

Dicha diana fue identificada mediante la implementación de un nuevo método bioinformático de predicción de nuevas dianas angiogénicas, predictor que fue publicado en: "Ian Morilla, Miguel A. Medina and lA.G. Ranea. Novel Angiogenic Functional Targets Predicted through "Dark Matter" Assessment in Protein Networks; Lecture Notes in Bioinformatics. Bioinformatics in Personalized Medicine. Springer-Verlag GmbH & Co. K. ISBN 978-3-642-28061-0. pp: 89-93 (2012) ." Este predictor prioriza todas las proteínas que componen el proteoma humano conocido basándose en la distancia media de dichas proteínas a un set de referencia de proteínas angiogénicas conocidas en la literatura. La distancia media se calcula dentro de un grafo o red de interacciones y asociaciones entre proteínas para cada diana potencial respecto del grupo de proteínas angiogénicas de referencia. Dichas redes de interacción se construyen a partir de datos experimentales y predicciones estadísticas y son de dominio y uso público. Con el predictor antes descrito se generó una lista priorizada de potenciales nuevas dianas implicadas estrechamente en el proceso angiogénico. La proteínas priorizadas en el tope superior de dicha lista fueron seleccionadas una a una y su potencial implicación en angiogénesis validada mediante mediante ensayos con anti-cuerpos. De estos test de validación experimental con anticuerpos sobre las proteínas seleccionadas fue identificada la proteína concreta objeto de esta solicitud de patente. La lista de genes priorizados y validados experimentalmente no ha sido publicada hasta el momento ni divulgada por ningún medio público.

Seleccionada la diana molecular se procedió a comprobar si modula alguna etapa del proceso angiogénico, como es la migración celular y la formación de estructuras tubulares. Esta aproximación se llevó a cabo mediante dos metodologías diferentes:

1. Silenciamiento génico de SOD-3 con siRNA en células HMEC. II-Pretratamiento de células HMEC con anticuerpo específico frente a SOD-3.

Tras realizar los ensayos con las células previamente silenciadas con siRNA, se comprobó que el silenciamiento génico de SOD-3 no alteró la capacidad de migración de las células endoteliales tras los periodos de incubación ensayados; en cambio, disminuyó sensiblemente la formación de estructuras tubulares. Para concluir que el efecto observado en los dos ensayos llevados a cabo fueron motivados por el silenciamiento, se comprobó el nivel de silenciamiento mediante "wesfern blof" y PCR en tiempo real.

Al realizar los ensayos con las células preincubadas con el anticuerpo específico frente a SOD-3, se observó una disminución en la capacidad de migración de las células, respecto a las células que no fueron preincubadas con el anticuerpo, en los periodos de 4 horas y 7 horas de incubación monotorizados. Además, el bloqueo de SOD-3 por parte del anticuerpo específico inhibió por completo la formación de estructuras tubulares.

En base a los resultados obtenidos mediante dos aproximaciones metodológicas diferentes, se puede asumir que la disminución en la expresión de SOD-3, al sólo impedir la reposición (Wu et al. Nucleic Acids Research, 32, DOr: 10.1 O 93/nar/gnhO1 O, 2003) de la proteína SOD-3, los efectos que se aprecian en los experimentos realizados son moderados, debido a que en las células aún existe proteína SOD-3 funcional que pueden ejercer su actividad. En cambio, al... [Seguir leyendo]

1. Uso de la enzima SOD-3 como diana molecular en prevención, terapia y/o tratamiento de patologías que cursan con angiogénesis, como por ejemplo degeneración macular 5 asociada a la edad, artritis reumatoide o psoriasis.

2. Uso de un anticuerpo que se une, reacciona o reconoce específicamente a la enzima SOD-3 que modula su actividad en prevención, terapia y/o tratamiento de patologías que cursan con angiogénesis, como por ejemplo degeneración macular asociada a la edad, artritis reumatoide o psoriasis.

3. Uso de un anticuerpo que se une, reacciona o reconoce específicamente a la enzima SOD-3 que inhibe su actividad en prevención, terapia y/o tratamiento de patologías que cursan con angiogénesis.

4. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 2 o 3 caracterizado por que el anticuerpo se une, reacciona o reconoce específicamente a la enzima SOD-3 humana.

5. Uso según la reivindicación anterior caracterizado por que el anticuerpo se une, reacciona o reconoce específicamente el péptido WTGEDSAEPNSDSAEWIRD (SEQ ID NO:1) , correspondiente a los aminoácidos 19-37 aminoterminales.

6. Uso según la reivindicación anterior caracterizado por que el anticuerpo es isotipo inmunoglobulina G.

7. Uso según la reivindicación anterior caracterizado por que el anticuerpo es policlonal.

8. Uso según la reivindicación anterior caracterizado por que el anticuerpo se ha producido en conejo.