Un marcador de suero para medir fibrosis hepática.

Un método para distinguir enfermedad del hígado cirrótica temprana de fibrótica en un mamífero,

que comprende:

a) generar un perfil de N-glicomas del suero de hidratos de carbono ligados en N o fragmentos de oligosacáridos derivados de los mismos, o derivados marcados de dichos hidratos de carbono ligados en N o dichos fragmentos, o características de dichos hidratos de carbono ligados en N o dichos fragmentos que se determinan por la estructura de dichos hidratos de carbono ligados en N o dichos fragmentos; estando dichos hidratos de carbono ligados en N o dichos fragmentos presentes en u obtenidos de las proteínas totales en suero que están presentes en o se aíslan de una muestra de suero sanguíneo de dicho mamífero, y

b) medir en el perfil de la etapa a) la cantidad de al menos un hidrato de carbono ligado en N o un fragmento de oligosacárido derivado del mismo o un derivado marcado de dicho hidrato de carbono ligado en N o dicho fragmento, o una característica de al menos un hidrato de carbono ligado en N o fragmento derivado del mismo presente en dicho perfil de hidratos de carbono ligados en N, y

c) comparar los datos medidos obtenidos en la etapa b) con datos medidos obtenidos de perfiles derivados de mamíferos libres de fibrosis hepática con el fin de distinguir enfermedad del hígado cirrótica temprana de fibrótica o, comparar los datos obtenidos en la etapa b) con datos previamente medidos en dicho mamífero con el fin de distinguir enfermedad del hígado cirrótica temprana de fibrótica y

d) atribuir los resultados de la comparación obtenida en la etapa c) para distinguir enfermedad del hígado cirrótica temprana de fibrótica.

Un marcador de suero para medir fibrosis hepática Campo de la invención La invención proporciona métodos y kits para detectar fibrosis hepática o un cambio en la progresión de la fibrosis hepática en mamíferos. El marcador de diagnóstico se basa en el perfilado e identificación de hidratos de carbono de diagnóstico presentes en un líquido corporal tal como suero sanguíneo.

Antecedentes de la invención La fibrosis hepática se caracteriza por la deposición de colágeno y otras proteínas de la matriz extracelular y su organización en polímeros complejos, que son insolubles e inducen la pérdida de la arquitectura del hígado. El colágeno y las proteínas de la matriz que constituyen la fibrosis se producen en gran parte por las células estrelladas hepáticas activadas. Las células estrelladas se activan de un fenotipo de lipocito quiescente a un fenotipo fibroblastoico. La activación se produce en 2 fases: inicialmente, la activación de células estrelladas por citocinas (especialmente TGF-beta) , quimiocinas y otras moléculas de señalización inducidas por el proceso inflamatorio, seguido de transformación de las células estrelladas en un fenotipo miofibroblastoico, en el que la célula puede proliferar, atraer leucocitos y producir colágeno extracelular y proteínas de la matriz. En todas las formas de hepatitis crónica, la fibrosis activa empieza alrededor de las áreas portales (zona periportal o fibrosis de zona 1, etapa de fibrosis 1 de Metavir) y gradualmente se extiende fuera en los lóbulos hacia las venas centrales (zona 3) , con formación de septo (etapa de fibrosis 2 de Metavir) . Entonces, se produce la conexión por puente (etapa de fibrosis 3 de Metavir) . La etapa final de la fibrosis (etapa de fibrosis 4 de Metavir) es la cirrosis temprana: amplia fibrosis que conecta las áreas portales y centrales, acompañada de regeneración nodular del parénquima del hígado. También se usan frecuentemente otras puntuaciones histológicas, aparte del sistema de Metavir, tales como la puntuación HAI. La puntuación HAI distingue sin fibrosis (grado 0) de fibrosis no en puente leve (grado 1) ; fibrosis en puente (grado 3) y cirrosis temprana (grado 4) . La fibrosis hepática acompaña a la mayoría de los trastornos crónicos del hígado y se caracteriza por el crecimiento de tejido cicatricial entre áreas de tejido funcional del hígado. Como tal, el crecimiento de tejido conjuntivo es una reacción normal a la lesión del tejido, pero puede 'pasarse', produciendo fibrosis hepática. La tasa de progresión de la fibrosis es el distintivo que define la enfermedad de enfermedades hepáticas crónicas, ya que es esta progresión de la fibrosis la que por último lugar conduce a la distorsión arquitectónica del hígado, y a la cirrosis. Es importante evaluar la etapa de la fibrosis y la tasa de progresión de la fibrosis, ya que algunos pacientes con enfermedad hepática crónica progresan rápidamente, terminando finalmente con cirrosis y las complicaciones potencialmente mortales asociadas, mientras que otros progresan muy lentamente, si lo hacen, y nunca podrían padecer complicaciones asociadas al hígado. Por tanto, generalmente se realiza biopsia del hígado en pacientes hepáticos crónicos recién diagnosticados. Sin embargo, ésta es una técnica de diagnóstico invasiva, frecuentemente dolorosa, que algunas veces va acompañada de complicaciones graves. Además, aunque se considera que es el 'estándar de oro' para la estadificación de la fibrosis, la biopsia del hígado podría submuestrear el estado verdadero de la enfermedad del hígado, ya que solo se sondea una pequeña área. Así, la biopsia del hígado no es muy adecuada como herramienta de seguimiento rutinaria. Una herramienta ideal para el seguimiento de la fibrosis hepática sería un biomarcador clínico no invasivo, cuyos valores medidos debieran correlacionarse con la etapa de fibrosis (la progresión de la fibrosis hepática) . Se han evaluado varios marcadores y conjuntos de marcadores hacia este objetivo, pero ninguno de ellos cumple completamente estos requisitos. Por ejemplo, se han usado componentes de la matriz extracelular presentes en suero, siendo el ácido hialurónico del suero aparentemente el más fiable. Sin embargo, el consenso que parece surgir de los cada vez más estudios que implican a este marcador es que puede ser bastante fiable para excluir cirrosis en varios pacientes (alto valor predictivo negativo) , aunque su exactitud en la detección de cirrosis sea baja (aproximadamente el 30 % de sensibilidad) . Recientemente se han estudiado mucho modelos de regresión logística binaria tales como {Fibrotest}, basados en una gama de analitos de bioquímica clínica, para estos fines (ref. 14, 15 y documento WO0216949) . Sin embargo, estos marcadores tienen una baja sensibilidad a niveles >95 % de especificidad que se requeriría para obviar la necesidad de biopsia en pacientes con enfermedad del hígado crónica, o para detectar fiablemente la aparición de cirrosis temprana en una configuración de seguimiento. Es evidente que se necesitan marcadores de suero adicionales con alta especificidad y buena sensibilidad para la monitorización no invasiva de fibrosis hepática y su progresión. En la presente invención, los presentes inventores han desarrollado un método de 'glicómica clínica' que usa un ciclador térmico de PCR estándar y un secuenciador de ADN automático/analizador de fragmentos para generar rápidamente perfiles de alta resolución de las modificaciones postraduccionales de N-glicanos presentes en las proteínas en el suero del paciente. Los presentes inventores muestran que el N-glicoma en suero da un biomarcador que distingue pacientes con enfermedad del hígado cirrótica temprana de fibrótica con el 79 % de sensibilidad y el 86 % de especificidad. Y, lo que es más importante, cuando el nuevo biomarcador de los presentes inventores se usa junto con el biomarcador {Fibrotest} basado en bioquímica clínica (que detecta cirrosis temprana en la presente invención con el 92 % de sensibilidad y el 76 % de especificidad) , la especificidad por la diferenciación entre casos de fibrosis y cirrosis temprana mejoró al 100 %, mientras que retuvo una sensibilidad del 75 %.

Breve descripción de las figuras y tablas

Fig. 1 Ejemplos del perfil de N-glicanos de proteínas totales en suero.

El panel superior contiene una referencia de malto-oligosacárido. El segundo panel muestra un electroferograma típico de los N-glicanos desialilados derivados de las proteínas en una muestra de suero de control. Nueve picos son claramente visibles en el intervalo de detección completo, cinco más en la ampliación 10x de la última parte del electroferograma. La altura de estos 14 picos se usó para obtener una descripción numérica de los perfiles de todas las muestras en este estudio. El tercer panel muestra un electroferograma representativo obtenido de un caso de cirrosis. Las estructuras de los N-glicanos que son de relevancia para este estudio se muestran debajo de los paneles, y los picos que se encontró que eran de relevancia particular para los marcadores de cirrosis están recuadrados. Símbolos de la unidad de monosacárido (también válidos para la Fig. 5) : GlcNAc ligada en ; Gal ligada en ; Man ligada en ; Man ligada en ; Fuc ligada en -1, 6.

Fig. 2 Tendencias en las variables de diagnóstico derivadas.

Las muestras de suero se clasificaron en 9 grupos clínicamente relevantes. Se derivaron tres variables de diagnóstico de perfiles como se muestra en la Fig. 1: Log (Pico 1/Pico 8) , Log (Pico 2/Pico 8) y Log (Pico 7/Pico 8) . La última se renombró GlycoCirrhoTest debido a su alta eficiencia de diagnóstico para la cirrosis. Obsérvese que la escala en las ordenadas es logarítmica. Las tres variables muestran una clara tendencia hacia mayores valores promedio con gravedad creciente de la enfermedad del hígado, y especialmente así en cirrosis (las barras de error son los intervalos de confianza del 95 % para la media) .

Fig. 3 Eficiencia de clasificación de las tres variables derivadas usando análisis ROC.

a) Se realizó el análisis de la curva ROC para evaluar la eficiencia de las tres variables mostradas en la Fig. 2 en diferenciar el grupo de muestras con cirrosis leve y el grupo con enfermedad del hígado crónica pre-cirrótica. Los valores de corte determinados de GlycoCirrhoTest y de las curvas ROC de {Fibrotest} se usaron en la sección b de esta figura para dividir los campos de los diagramas de dispersión bidimensionales en cuadrantes. b) Diagramas de dispersión bidimensionales que clasifican el grupo de muestras de cirrosis y el grupo de enfermedad del hígado crónica pre-cirrótica. Panel superior: Se detectan casos de cirrosis bioquímicamente compensada con/sin HCC con 75 %... [Seguir leyendo]

1. Un método para distinguir enfermedad del hígado cirrótica temprana de fibrótica en un mamífero, que comprende:

a) generar un perfil de N-glicomas del suero de hidratos de carbono ligados en N o fragmentos de oligosacáridos derivados de los mismos, o derivados marcados de dichos hidratos de carbono ligados en N o dichos fragmentos, o características de dichos hidratos de carbono ligados en N o dichos fragmentos que se determinan por la estructura de dichos hidratos de carbono ligados en N o dichos fragmentos; estando dichos hidratos de carbono ligados en N o dichos fragmentos presentes en u obtenidos de las proteínas totales en suero que están presentes en o se aíslan de una muestra de suero sanguíneo de dicho mamífero, y b) medir en el perfil de la etapa a) la cantidad de al menos un hidrato de carbono ligado en N o un fragmento de oligosacárido derivado del mismo o un derivado marcado de dicho hidrato de carbono ligado en N o dicho fragmento, o una característica de al menos un hidrato de carbono ligado en N o fragmento derivado del mismo presente en dicho perfil de hidratos de carbono ligados en N, y c) comparar los datos medidos obtenidos en la etapa b) con datos medidos obtenidos de perfiles derivados de mamíferos libres de fibrosis hepática con el fin de distinguir enfermedad del hígado cirrótica temprana de fibrótica o, comparar los datos obtenidos en la etapa b) con datos previamente medidos en dicho mamífero con el fin de distinguir enfermedad del hígado cirrótica temprana de fibrótica y d) atribuir los resultados de la comparación obtenida en la etapa c) para distinguir enfermedad del hígado cirrótica temprana de fibrótica.

2. Un método según la reivindicación 1, en el que dicho al menos un hidrato de carbono ligado en N está seleccionado del grupo que consiste en:

i) GlcNAc (-1, 2) Man (-1, 3) [GlcNAc (-1, 2) Man (-1, 6) ]Man (-1, 4) GlcNAc (-1, 4) [Fuc (-1, 6) ]GlcNAc (glicano 1) , ii) GlcNAc (-1, 2) Man (-1, 3) [GlcNAc (-1, 4) ][GlcNAc (-1, 2) Man (-1, 6) ]Man (-1, 4) GlcNAc (-1, 4) [Fuc (1, 6) ]GlcNAc (el glicano 2) , iii) Gal (-1, 4) GlcNAc (-1, 2) Man (-1, 3) [GlcNAc (-1, 4) ][Gal (-1, 4) GlcNAc (-1, 2) Man (-1, 6) ]Man (-1, 4) GlcNAc (1, 4) [Fuc (-1, 6) ]GlcNAc (glicano 7) , 30 iv) Gal (-1, 4) GlcNAc (-1, 2) [Gal (-1, 4) GlcNAc (-1, 4) ]Man (-1, 3) [Gal (-1, 4) GlcNAc (-1, 2) Man (-1, 6) ]Man (

1, 4) GlcNAc (-1, 4) GlcNAc (el glicano 8) , v) un fragmento de oligosacárido derivado del glicano 1, 2, 7 u 8, vi) un derivado sialilado del glicano 1, 2, 7 u 8, vii) una característica de glicano 1, 2, 7 u 8 o derivado o fragmento de oligosacárido del mismo.

3. Un método según la reivindicación 2, en el que dicha cantidad se mide como una cantidad relativa entre el glicano 1 y el glicano 8 y/o el glicano 2 y el glicano 8 y/o glicano 7 y el glicano 8 o un fragmento de oligosacárido, derivado sialilado o característica del mismo.

4. Un método según la reivindicación 3, en el que la cantidad relativa entre el glicano 2 y el glicano 8 o un fragmento de oligosacárido, derivado sialilado o característica del mismo se usa para medir un cambio lineal en la progresión de la fibrosis hepática.

5. Un método según las reivindicaciones 1-4, en el que dicho mamífero es un ser humano. 45

6. Un método para detectar fibrosis hepática o un cambio en la progresión de la fibrosis hepática en un mamífero según las reivindicaciones 1-5 que comprende además la medición de evaluaciones cuantitativas o cualitativas de la condición física del mamífero, tales como los parámetros de bioquímica clínica.

7. Un método según la reivindicación 6, en el que dicha medición de los parámetros de bioquímica clínica comprende medir niveles de 2-macroglobulina, haptoglobulina, GGT, bilirrubina, apolipoproteína A1 y determinar la edad y sexo y calcular una puntuación para el modelo de regresión logística binaria Fibrotest.