Procedimiento para purificar lipopéptidos.

Procedimiento para purificar daptomicina que comprende las etapas siguientes

a) cargar una solución que comprende daptomicina purificada parcialmente sobre una columna de cromatografía de intercambio aniónico;

b) cargar la solución de la etapa a) sobre una columna de cromatografía de fase inversa;

c) cargar opcionalmente la solución de la etapa b) sobre otra columna de cromatografía de fase inversa por lo menos una vez;

en el que el tampón de elución de a) es una solución de sal monovalente y el tampón de elución de b) es alcohol acuoso.

Procedimiento para purificar lipopéptidos.

Campo de la invención La presente invención se refiere a un procedimiento mejorado de purificación para la purificación de daptomicina, representada por el nombre químico 1-lactona de N-decanoil-L-triptofil-D-asparaginil-L-aspartil-L-treonilglicil-Lornitil-L-aspartil-D-alanil-L-aspartilglicil-D-seril-treo-3-metil-L-glutamil-3-antraniloil-L-alanina. La daptomicina se puede representar mediante la fórmula I:

** (Ver fórmula) **

Antecedentes La daptomicina es un antibiótico lipopéptido con actividad frente a microorganismos grampositivos. Se produce mediante fermentación de Streptomyces roseosporus seguida de purificación del caldo de fermentación. El mecanismo de acción de la daptomicina consiste en que se une a las membranas bacterianas y provoca una rápida despolarización del potencial de membrana. Esta pérdida del potencial de membrana provoca una inhibición de las proteínas y una síntesis de ADN y ARN que conduce a la muerte celular bacteriana. La utilización de la daptomicina está aprobada para infecciones complicadas de la piel y sus estructuras (cSSSI) , y para septicemias por Staphylococcus aureus (bacteriemia) . La daptomicina está comercializada por Cubist Pharmaceuticals con el nombre comercial Cubicin®

La daptomicina fue descrita por primera vez a mediados de la década de los ochenta en diversas patentes y publicaciones periódicas: en la patente US nº 4.537.717 y en Debono M. y otros, Journal of Antibiotics, 1986, vol. XL, n.º 6, 761-777. Desde entonces se han publicado diversos trabajos dedicados a procesos de fermentación y procesos de purificación mejorados.

En la patente US nº 4.885.243 se describe un procedimiento de fermentación mejorado para la fabricación de daptomicina. Dicho procedimiento describe el suministro de ácido decanoico o un éster de dicho ácido graso, o sales de los mismos, a un caldo de fermentación de Streptomyces roseosporus. Durante la fermentación, el ácido decanoico se inserta en la molécula, formándose la cadena lateral de decanoico de la daptomicina.

En la técnica anterior se han descrito diversos procedimientos de purificación para purificar la daptomicina. La patente US nº 4.874.843 describe un procedimiento para purificar daptomicina en el que el caldo de fermentación se filtra y se introduce en una columna cromatográfica que contiene resina HP-20. Tras la elución, la daptomicina semipurificada se hace pasar a través de una columna que contiene resina HP-20ss y se introduce a continuación en otra columna que contiene resina HP-20. Además de estas etapas, se describen intentos de aumentar la pureza con diversas etapas cromatográficas adicionales, sin ningún éxito. La patente `843 da a conocer además que, mediante la utilización de una resina no funcional y una solución acuosa, e incluyendo una etapa en la que el agua se elimina físicamente y luego se rehumedece la resina con un disolvente orgánico polar, la pureza del producto se aumenta del 80% al 93%. Este procedimiento consume mucho tiempo y no resulta muy adecuado para la producción industrial.

El documento US RE 39071 describe las dos impurezas principales encontradas en la producción de daptomicina, la anhidro-daptomicina y el isómero beta de la daptomicina. El documento US RE 39071 establece, además, que mediante la forma de realización del procedimiento descrito en los ejemplos 1-3 se obtiene un producto de daptomicina que comprende menos del 6% de las dos impurezas mencionadas. El ejemplo 3 describe un procedimiento en el que la daptomicina de calidad intermedia se purifica adicionalmente en un procedimiento que comprende cuatro etapas cromatográficas y etapas adicionales de desalación, concentración y liofilización. En las etapas cromatográficas, se utiliza acetonitrilo para el lavado y la elución y, además, hay que llevar a cabo el método con soluciones refrigeradas y en un entorno refrigerado.

La patente US nº 6.696.412 da a conocer un procedimiento para purificar daptomicina mediante la utilización de una etapa de cromatografía de intercambio aniónico, en la que se utiliza un tampón modificado para la elución, y una etapa de microfiltración, en la que la daptomicina forma micelas. En esta patente se describen diversos métodos que son una combinación de las dos etapas mencionadas anteriormente junto con otras etapas de purificación conocidas por el experto en la materia. El producto de daptomicina altamente purificado se define en dicha patente como daptomicina con un nivel de pureza del 95-97%.

El documento US 2007/191280 da a conocer, entre otras cosas, un procedimiento para la preparación de daptomicina.

También se hace referencia a Gu y otros, Journal Natural Products, vol. 70, n.º 2, febrero de 2007, p. 233-24, que se refiere a la caracterización estructural de los análogos de la daptomicina producidos por una cepa recombinante de Streptomyces roseosporus.

Características de la invención La presente invención da a conocer un procedimiento de purificación mejorado para la purificación de daptomicina, que da lugar a un producto con una pureza de por lo menos 95%. El procedimiento descrito es más simple que los descritos en la técnica anterior y, tal como se describe a continuación, hace superflua la utilización de tampones modificados y evita el uso de acetonitrilo, lo que supone un beneficio para el medio ambiente.

El procedimiento según la presente invención utiliza las etapas de cromatografía de intercambio aniónico y cromatografía de fase inversa. Además, se pueden llevar a cabo las etapas normales de filtración y la liofilización del producto final.

En particular, se da a conocer un procedimiento para la purificación de daptomicina, que comprende las siguientes etapas: a) carga de una solución que comprende daptomicina parcialmente purificada en una columna de cromatografía de intercambio aniónico; b) carga de la solución de la etapa a) en una columna de cromatografía de fase inversa; c) opcionalmente, carga de la solución de la etapa b) en otra columna de cromatografía de fase inversa, por lo menos una vez; en el que el tampón de elución de a) es una solución de sal monovalente y el tampón de elución de b) es alcohol acuoso.

La presente invención da a conocer, además, un procedimiento para la purificación de daptomicina, que comprende las siguientes etapas: a) someter un caldo de fermentación, que comprende daptomicina, a una o varias etapas de 35 clarificación; b) carga de la solución de la etapa a) en una columna de cromatografía de intercambio aniónico; c) carga de la solución de la etapa b) en una columna de cromatografía de fase inversa; d) opcionalmente, carga de la solución de la etapa c) en otra columna de cromatografía de fase inversa, por lo menos una vez; e) sometimiento de la solución resultante de la etapa d) a una o varias etapas de filtración; f) sometimiento del filtrado de d) a liofilización; obteniéndose un polvo purificado de daptomicina; en el que el tampón de elución de la etapa c) y, opcionalmente, de la etapa d) , es alcohol acuoso.

Según una forma de realización, la solución salina monovalente utilizada como tampón de elución en las etapas cromatográficas de intercambio aniónico es una solución de cloruro de sodio en agua.

Preferentemente, el alcohol acuoso de la etapa b) es etanol acuoso. Según una forma de realización de la presente invención, la daptomicina se eluye de la etapa cromatográfica de fase inversa utilizando un tampón de elución que comprende etanol al 5-80%.

La presente invención se puede ilustrar mediante las etapas que se indican en el esquema de reacción 1. 50

** (Ver fórmula) **

La presente invención da lugar a un producto de daptomicina con una pureza total del 95% o mayor. La cantidad de anhidro-daptomicina varía entre el 0, 5% y el 1, 5%, y la cantidad del isómero beta es inferior a 0, 5%.

El procedimiento según la presente invención da a conocer un procedimiento de purificación que es más simple que los procedimientos conocidos en la técnica con respecto a los tampones y etapas utilizados, y evita la utilización de disolventes tóxicos para el medio ambiente. Además, da lugar a una separación muy buena y a niveles bajos de las dos impurezas más importantes, la anhidro-daptomicina y el isómero beta de la daptomicina. El procedimiento según la presente invención proporciona un procedimiento de purificación simple, a la vez que proporciona un producto que es por lo menos tan puro como los productos descritos en la técnica anterior.

Descripción detallada de la invención El material de partida del procedimiento según la presente invención puede obtenerse por el método descrito... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para purificar daptomicina que comprende las etapas siguientes a) cargar una solución que comprende daptomicina purificada parcialmente sobre una columna de cromatografía de intercambio aniónico;

b) cargar la solución de la etapa a) sobre una columna de cromatografía de fase inversa;

c) cargar opcionalmente la solución de la etapa b) sobre otra columna de cromatografía de fase inversa por lo menos una vez;

en el que el tampón de elución de a) es una solución de sal monovalente y el tampón de elución de b) es alcohol acuoso. 15

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que se llevan a cabo una o varias etapas de clarificación antes de la etapa de cromatografía de intercambio aniónico a) .

3. Procedimiento según la reivindicación 1-2, en el que el producto de la etapa de cromatografía de fase inversa b) se purifica además mediante una o varias etapas de filtración.

4. Procedimiento según la reivindicación 3, en el que el producto de la fase inversa es seguido además por una etapa de liofilización.

5. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la solución de elución en a) es NaCl.

6. Procedimiento según la reivindicación 2, en el que el tampón de elución es NaCl 0, 1-1, 5 M.

7. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el tampón de elución en b) es etanol acuoso.

8. Procedimiento según la reivindicación 7, en el que el tampón de elución es etanol al 5-80%.

9. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la etapa de cromatografía de intercambio aniónico se lleva a

cabo utilizando una resina de agarosa altamente reticulada con un extensor de superficie dextrano. 35

10. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la etapa de cromatografía de fase inversa se lleva a cabo utilizando una columna de resina a base de estireno.

11. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la etapa b) se repite una vez.

12. Procedimiento según la reivindicación 11, en el que la primera columna de cromatografía de fase inversa se eluye a un pH de 6, 5-8, 5.

13. Procedimiento según la reivindicación 11, en el que la segunda columna de cromatografía de fase inversa se 45 eluye a un pH de 2, 5-3, 5.

14. Procedimiento para purificar daptomicina que contiene las etapas siguientes a) someter un caldo de fermentación que comprende daptomicina a una o varias etapas de clarificación; b) cargar la solución de la etapa a) sobre una columna de cromatografía de intercambio aniónico; c) cargar la solución de la etapa b) sobre una columna de cromatografía de fase inversa;

d) cargar opcionalmente la solución de la etapa c) sobre otra columna de cromatografía de fase inversa por lo menos una vez; e) someter la solución resultante de la etapa d) a una o varias etapas de filtración; f) someter el filtrado de d) a liofilización; dando como resultado un polvo purificado de daptomicina; en el que el tampón de elución en la etapa c) y opcionalmente en la etapa d) , es alcohol acuoso.

15. Procedimiento según la reivindicación 14, en el que las etapas de clarificación en a) es una o una combinación 65 de las técnicas siguientes: ósmosis inversa, centrifugación, filtración, ultrafiltración, nanofiltración, cromatografía de intercambio aniónico.

16. Procedimiento según la reivindicación 14, en el que la solución de elución de b) es NaCl.

17. Procedimiento según la reivindicación 16, en el que el tampón de elución es NaCl 0, 1-1, 5 M.

18. Procedimiento según la reivindicación 14, en el que el tampón de elución de c) es etanol acuoso.

19. Procedimiento según la reivindicación 18, en el que el tampón de elución es etanol al 5-80%. 10 20. Procedimiento según la reivindicación 14, en el que la etapa c) se repite una vez.