Procedimiento de detección de compuestos de Pneumocandina.

Procedimiento de detección de Pneumocandina B0 y/o Pneumocandina C0 en una muestra,

en el que se detecta(n) un fragmento específico de Pneumocandina B0 y/o un fragmento específico de Pneumocandina C0 utilizando espectrometría de masas en tándem en modo negativo.

Procedimiento de detección de compuestos de Pneumocandina.

Campo de la invención La presente invención se refiere a procedimientos de detección de compuestos de Pneumocandina.

Antecedentes Las Pneumocandinas son hexapéptidos cíclicos antifúngicos con una cadena lateral lipídica (véase Schwarts et al, 1992, Journal of antibiotics, vol. 45, nº 12, páginas 1853-1866, Masurekar et al, 1992, Journal of Antibiotics, vol. 45, nº 12, páginas 1867-1874, Hensens et al, 1992, Journal of Antibiotics, vol. 45, nº 12, páginas 1875-1885, Schmatz et al, 1992, Journal of Antibiotics, vol. 45, nº 12, páginas 1886 -1891 y Adefarati et al , 1992, Journal of Antibiotics,

vol. 45, nº 12, páginas 1953-1957 y documento US 5.021.341) .

La actividad antifúngica de las Pneumocandinas está relacionada con la inhibición de la biosíntesis de 1, 3βglucanos. La 1, 3β-glucano sintasa, una enzima de múltiples subunidades, es responsable de la construcción de la pared celular fúngica, la deposición del tabique de división y el ensamblaje de la pared de la ascospora. La subunidad catalítica de este complejo enzimático, una proteína integral de la membrana, se ha identificado tanto en las levaduras modelo Saccharomyces cerevisiae y Schizosaccharomyces pombe, como en hongos patógenos tales como especies de Candida, Aspergillus, Cr y ptococcus y Pneumocystis. (Curr Drug Targets Infect Disord. Agosto de 2001; 1 (2) : 159-69 por Liu y Balasubramanian) .

Las Pneumocandinas y los derivados de Pneumocandina son útiles como principios farmacéuticos activos (API) y/o productos intermedios para producir API. Los fármacos que comprenden los API están previstos para su utilización en el tratamiento terapéutico o profiláctico de enfermedades o estados que implican infecciones fúngicas.

Por ejemplo, el API caspofungina es un derivado semisintético de Pneumocandina B0. La caspofungina, 30 comercializada como Cancidas®, está indicada en adultos y pacientes pediátricos (3 meses y mayores) para:

-Terapia empírica para supuestas infecciones fúngicas en pacientes febriles, neutropénicos.

-Tratamiento de candidemia y las siguientes infecciones por Candida: abscesos intraabdominales, peritonitis e 35 infecciones del espacio pleural.

-Tratamiento de candidiasis esofágica.

-Tratamiento de aspergilosis invasiva en pacientes que son resistentes o intolerantes a otras terapias. 40 Por tanto, se requiere una alta pureza del API para la seguridad y eficacia de los fármacos.

Puede utilizarse Pneumocandina B0 como material de partida para producir caspofungina. Durante tal producción, se considerará Pneumocandina C0 como una impureza. Por tanto, es deseable monitorizar y controlar tanto el 45 contenido de Pneumocandina B0 así como el contenido de Pneumocandina C0.

A menudo se produce Pneumocandina B0 mediante fermentación del hongo Glarea lozoyensis (anteriormente clasificado como Zalerion arboricola) , pero se producen conjuntamente muchos isómeros y derivados con propiedades fisicoquímicas similares en los procedimientos de fermentación.

La Pneumocandina B0 y la Pneumocandina C0 son isómeros que difieren por la posición de un grupo hidroxilo en un residuo de prolina únicamente:

Se conocen varios procedimientos para la detección de Pneumocandinas. Sin embargo, generalmente son engorrosos e ineficaces para la detección selectiva de Pneumocandina B0 o la detección selectiva de 5 Pneumocandina C0. Por ejemplo, la cristalización y la cromatografía de fase inversa no pueden separar Pneumocandina B0 de Pneumocandina C0. La cromatografía de fase normal que utiliza fases móviles de acetato de etilo/metanol/agua puede separar Pneumocandina B0 de Pneumocandina C0. Sin embargo, este procedimiento adolece de una baja solubilidad de la Pneumocandina en la disolución de carga y también de algo de mala robustez. Además, esta fase móvil no es muy compatible con procedimientos espectrométricos de masas, lo que limita la utilidad del procedimiento para fines analíticos.

Técnica anterior relevante Documento US 5194377 15 J Mass Spectrom. Abril de 2007; 42 (4) :440-9 por Rochat et al. Detection of Caspofungin by LC-EM/EM in plasma.

Rapid Commun Mass Spectrom. 2004; 18 (23) :2871-7 por Egle et al. Double column-switching technique (LC-LC) for liquid chromatography/electrospray ionisation tandem mass spectrometr y for fully automated analysis of 20 Caspofungin.

J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 1 de septiembre de 2008; 872 (1-2) :1-22. Publicación electrónica 26 de julio de 2008. Quantitative bio analysis of peptides by liquid chromatography coupled to (tandem) mass spectrometr y .

Journal of mass spectrometr y : JEM, (julio de 1999) vol. 34, nº 7, págs. 733-40 por Oin et al. Collision-induced dissociation of protonated MK-0991: novel ring opening of a cyclic hexapeptide in the gas phase.

J Chromatogr A 1999; 831:217-225 por Osawa et al. Purification of pneumocandins by preparative silica gel high30 performance liquid chromatography.

Las siguientes abreviaturas se utilizan con el significado especificado a lo largo de toda esta memoria descriptiva:

Abreviaturas API -Principio (s) farmacéutico (s) activo (s) EM-Espectrometría de masas EM/EM -Espectrometría de masas en tándem CL -Cromatografía de líquidos ACN -Acetonitrilo AmAc -Acetato de amonio HILIC -Cromatografía de líquidos de interacción hidrófila HPLC -Cromatografía de líquidos de alta resolución Q -Cuadrupolo 45 TOF -Tiempo de vuelo EC -Energía de colisión

Sumario de la invención La presente invención se refiere a la detección específica de Pneumocandina B0 y/o la detección específica de Pneumocandina C0 mediante espectrometría de masas (EM) . La invención se basa en el descubrimiento sorprendente de un comportamiento de fragmentación diferente de B0 en comparación con C0.

La invención puede utilizarse para detectar estas moléculas específicamente. También puede utilizarse para monitorizar la presencia de estas moléculas en una muestra, o en un procedimiento industrial. Por tanto, incluso cuando no se separan cromatográficamente Pneumocandina B0 y C0, un experto en la materia puede analizar el contenido del compuesto B0 a menudo deseado durante un procedimiento de fabricación. De manera simultánea o alternativa, puede analizarse el contenido del compuesto C0 pocas veces deseado durante un procedimiento de fabricación. El conocimiento y la documentación del contenido de estos compuestos son importantes para cualquier producción comercial o científica de Pneumocandina B0 o Pneumocandina C0.

Descripción detallada de la invención La detección de Pneumocandinas puede realizarse con detección UV. Para fines analíticos, se utiliza más preferiblemente un detector de EM que puede realizar EM/EM. En el contexto de la presente invención se descubrió sorprendentemente, realizando EM/EM en modo de ión tanto positivo como negativo, que Pneumocandina B0 y Pneumocandina C0 se fragmentan de manera diferente cuando se elige el ión molecular desprotonado ([M-H]-) para EM/EM. De manera notable, pueden encontrarse iones de fragmentos que son específicos para (es decir, que el ión del fragmento se produce exclusivamente sólo para uno de los isómeros) o casi específicos para (es decir, que el ión del fragmento se produce en una abundancia mucho más alta para uno de los isómeros) Pneumocandina B0 y Pneumocandina C0, respectivamente. Para Pneumocandina B0, estos iones presentan valores de m/z de por ejemplo 300, 416 y 452. Para Pneumocandina C0, estos iones presentan valores de m/z de por ejemplo 338, 356 y

360.

Combinando la separación cromatográfica con la monitorización de esos fragmentos específicos (preferiblemente utilizando tecnología de CL-EM/EM) para Pneumocandina B0 y Pneumocandina C0, es posible detectar y cuantificar Pneumocandina B0 y Pneumocandina C0 en muestras fermentadas complejas.

Deben incluirse patrones de referencia auténticos para Pneumocandina B0 y Pneumocandina C0 en relación con el análisis. La identidad del isómero respectivo en la muestra se determina a partir de la comparación de los tiempos de retención y los fragmentos específicos con los patrones de referencia auténticos. Las cuantificaciones de Pneumocandina B0 y Pneumocandina C0 se realizan a partir de la comparación del área con los patrones de referencia auténticos (utilizando curvas de calibración) , ya que el área del pico de isómero respectivo es proporcional a la cantidad del isómero respectivo.

Para poder crear un procedimiento analítico para analizar el contenido de B0 y C0 en una muestra, era necesario o bien separar los dos compuestos cromatográficamente... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento de detección de Pneumocandina B0 y/o Pneumocandina C0 en una muestra, en el que se detecta (n) un fragmento específico de Pneumocandina B0 y/o un fragmento específico de Pneumocandina C0 5 utilizando espectrometría de masas en tándem en modo negativo.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el fragmento específico para Pneumocandina B0 está a aproximadamente m/z 300, 439 o 469.

3. Procedimiento según la reivindicación 2, en el que la energía de colisión es de aproximadament.

3. 60 V.

4. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el fragmento específico para Pneumocandina B0 está a aproximadamente m/z 724.

5. Procedimiento según la reivindicación 4, en el que la energía de colisión es de aproximadament.

3. 45 V.

6. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el fragmento específico para Pneumocandina B0 está a aproximadamente m/z 326.

7. Procedimiento según la reivindicación 6, en el que la energía de colisión es de aproximadamente 55 V.

8. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el fragmento específico para Pneumocandina C0 está a aproximadamente m/z 507 a una energía de colisión de aproximadament.

4. 60 V.

9. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el fragmento específico para Pneumocandina C0 está a aproximadamente m/z 139, 280 o 338.

10. Procedimiento según la reivindicación 9, en el que la energía de colisión es de aproximadamente 60 V.

11. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el fragmento específico para Pneumocandina B0 está a aproximadamente m/z 300, 416 o 452.

12. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el fragmento específico para Pneumocandina C0 está a aproximadamente m/z 338 o 360. 35