Proteínas N-glicosiladas recombinantes procedentes de células procariotas.

Uso de una o varias secuencias de aminoácidos que comprenden la secuencia D/E- X- N- Z-S/T,

en donde X y Z pueden ser cualquier aminoácido natural excepto prolina, para modificar una proteína de tal manera que la proteína es susceptible de ser N-glicosilada por una oligosacaril transferasa de Campylobacter spp.

Proteínas N-glicosiladas recombinantes procedentes de células procarlotas.

La presente invención se refiere al uso de una o varias secuencias de consenso de aminoácidos N-glicosilados optimizados, en la modificación de una proteína de modo que la proteína es capaz de ser N-gilcosllada por una oligosacaril transferasa de Campylobacter spp.

Antecedentes de la invención

La glicosilación de proteínas ligada a N es un proceso esencial y conservado que tiene lugar en el retículo endoplásmico de organismos eucariotas. Es importante para el plegamlento de las proteínas, la ollgomerlzaclón, la estabilidad, el control de calidad, la clasificación y el transporte de proteínas secretoras y de membrana (Helenlus, A. y Aebi, M. (2004). Roles of N-linked glycans in the endoplasmic reticulum. Annu. Rev. Biochem. 73, 1019-1049).

La glicosilación de proteínas influye extremadamente sobre la antigenlcldad, la estabilidad y la semivida de una proteína. Además, la glicosilación puede ayudar a la purificación de proteínas mediante cromatografía, por ejemplo, cromatografía de afinidad con ligandos de lectina unidos a una fase sólida que interaccionan con restos glicosilados de la proteína. Por lo tanto, producir de forma recombinante muchas proteínas glicosiladas en células eucariotas para obtener patrones de glicosilación de utilidad biológica y farmacéutica es una práctica establecida.

Solo en los últimos años se ha demostrado que una bacteria, el agente patógeno Campylobacter jejuni transmitido por los alimentos, también puede N-glicosilar sus proteínas (Szymanski, et al. (1999). Evidence for a system of general protein glycosylation in Campylobacter jejuni, Mol. Microbiol. 32, 1022-1030). La maquinaria necesaria para la glicosilación está codificada por 12 genes que se agrupan en el locus denominado pgl. La alteración de la N- glicosilación afecta a la invasión y la patogénesis de C. jejuni pero no es letal como en la mayoría de los organismos eucariotas (Burda P. y M. Aebi, (1999). The dolichol pathway of N-linked glycosylation. Biochim Biophys Acta 1426(2):239-57). Es posible reconstituir la N-glicosilación de las proteínas de C. jejuni mediante una expresión recombinante del locus pgl y de la glicoproteína aceptora en E. coli al mismo tiempo (Wacker et al. (2002). N-linked glycosylation in Campylobacter jejuni and its functional transfer into E. coli. Science 298, 1790-1793).

En el documento de solicitud de Patente Europea n° 03 702 276.1 (Patente Europea 1 481 057), una invención anterior de los presentes inventores, se describe un organismo procariota en el que se introduce un ácido nucleico que codifica (i) glicosiltransferasas específicas para el acoplamiento de un ollgosacárldo sobre un vehículo lipídico, (¡i) una proteína diana recombinante que comprende una secuencia de consenso "N - X - S/T", en donde X puede ser cualquier aminoácido excepto prolina, y (iii) una oligosacaril transferasa de C. jejuni (OTasa) que une covalentemente dicho oligosacárido con la secuencia de consenso sobre la proteína diana. Dicho organismo procariota produce N-glicanos con una estructura específica que se define por el tipo de las glicosiltransferasas específicas.

Aun cuando la presencia de la secuencia de consenso de N-glicosilación conocida en una proteína permite la N- glicosilación de proteínas diana recombinantes en organismos procariotas que comprenden la oligosacaril transferasa (OTasa) de C. jejuni, la N-glicosllaclón de algunos proteínas diana es frecuentemente ineficaz.

El documento WO 03074687 describe un sistema para la producción de gllcoproteínas recombinantes en E. coli utilizando la proteína AcrA como una proteína modelo.

Wacker et al., Science, American Association for the Advancement of Science, EEUU., Vol 298, 29 de noviembre de 2002, págs. 1790-1793, describen el sistema de glicosilación ligado a N del locus pgl obtenido a partir de la bacteria Campylobacter jejuni y transferido funcionalmente a E. coli.

Nita-Lazar et al, Glycobiology, vol 15, n° 4, abril de 2005, págs. 361-367, describen los requisitos de la secuencia de polipéptidos del receptor para la N-glicosilación en la N-glicosllación reconstituida de la proteína modelo AcrA en £. coli.

El objeto de la presente invención es proporcionar proteínas, así como medios y métodos para producir tales proteínas que tienen un rendimiento optimizado para la N-glicosilación, que se pueden producir en organismos procariotas in vivo. Otro objeto de la presente Invención se dirige a la introducción más eficaz de N-glicanos en proteínas recombinantes para modificar la antlgenicidad, la estabilidad y la actividad biológica, profiláctica y/o terapéutica de dichas proteínas. Un objeto adicional es el suministro de una célula hospedadora que muestra de manera eficaz en su superficie proteínas N-glicosiladas recombinantes de la presente invención.

En un primer aspecto, la presente invención proporciona el uso de una o varias secuencias de aminoácidos que comprenden la secuencia D/E- X- N- Z-S/T, en donde X y Z pueden ser cualquier aminoácido natural excepto prolina, para modificar una proteína de tal manera que la proteína sea capaz de ser N-gilcosllada por una oligosacaril transferasa de Campylobacter spp.

Se encontró sorprendentemente que la introducción de una(s) secuencia(s) de aminoácidos específica(s) parcial(es) (secuencia(s) de consenso optimizada(s)) en las proteínas conduce a proteínas que se N-glicosilan de manera eficaz con la oligosacaril transferasa (OST, OTasa) de Campylobacter spp., preferiblemente C. jejuni, en estas posiciones introducidas.

La expresión "secuencia(s) parcial(es) de aminoácidos" tal como se utiliza en el contexto de la presente invención, también se puede denominar "secuencia(s) de consenso optimizada(s)". La secuencia de consenso optimizada se N-glicosila con la oligosacaril transferasa (OST,[mwi] OTasa) de Campylobacter spp., preferiblemente C. jejuni, mucho más eficazmente que la secuencia de consenso normal "N - X - S/T", conocida en la técnica anterior.

En general, la expresión "proteína N-glicosilada recombinante" se refiere a cualquier polipéptido u oligopéptido heterólogo producido en una célula hospedadora que no comprende de forma natural el ácido nucleico que codifica dicha proteína. En el contexto de la presente invención, esta expresión se refiere a una proteína producida de forma recombinante en cualquier célula hospedadora, por ejemplo, una célula hospedadora eucariota o procariota, preferiblemente una célula hospedadora procariota, p. ej., Escherichia ssp., Campylobacter ssp., Salmonella ssp., Shigella ssp., Helicobacter ssp., Pseudomonas ssp., Bacillus ssp., más preferiblemente Escherichia coli, Campylobacter jejuni, Salmonella typhimurium etc., en donde el ácido nucleico que codifica dicha proteína ha sido introducido en dicha célula hospedadora y en donde la proteína codificada está N-glicosilada por la OTasa de Campylobacter spp., preferiblemente C. jejuni, siendo dicha enzima transferasa de origen natural o habiéndose introducido de forma recombinante en dicha célula hospedadora.

De acuerdo con el código de una letra aceptado internacionalmente para los aminoácidos, las abreviaturas D, E, N, S y T significan ácido aspártico, ácido glutámico, asparagina, serina y treonina, respectivamente. Las proteínas de acuerdo con la Invención difieren de las proteínas naturales o de la técnica anterior en que una o varias de las secuencias de consenso optimizadas D/E - X - N - Z - S/T se introducen y se N-glicosilan. Por lo tanto, las proteínas de la presente Invención difieren de las proteínas de origen natural de C. jejuni que también contienen la secuencia de consenso optimizada pero no comprenden ninguna secuencia de consenso optimizada adicional (introducida).

La introducción de la secuencia de consenso optimizada se puede lograr mediante la adición, deleción y/o sustitución de uno o varios aminoácidos. La adición, deleción y/o sustitución de uno o varios aminoácidos con el fin de introducir la secuencia de consenso optimizada, se puede lograr mediante estrategias de síntesis química bien conocidas por los expertos en la técnica, tales como la síntesis química de péptidos facilitada por una fase sólida. Alternativamente y de forma preferida para polipéptidos más largos, las proteínas de la presente invención se pueden preparar mediante técnicas recombinantes convencionales.

Las proteínas modificadas de acuerdo con la presente invención tienen la ventaja de que se pueden producir con mucha eficacia y en cualquier hospedador procariota que comprende un operón pgl funcional procedente de Campylobacter spp., preferiblemente de C. jejuni. OTasas... [Seguir leyendo]

1. Uso de una o varias secuencias de aminoácidos que comprenden la secuencia D/E- X- N- Z-S/T, en donde X y Z pueden ser cualquier aminoácido natural excepto prolina, para modificar una proteína de tal manera que la proteína es susceptible de ser N-glicosilada por una oligosacaril transferasa de Campylobacter spp.

2. Uso según la reivindicación 1, en donde la proteína es modificada mediante la introducción en dicha proteína dichas una o varias secuencias de aminoácidos.

3. Uso según la reivindicación 1, en donde la proteína es modificada mediante adición, deleción y/o sustitución de uno o varios aminoácidos en dicha proteína.

4. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde Campylobacter spp. es C.jejuni.

5. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde la proteína comprende adicionalmente un glicano enlazado a cada una de dichas una o varias secuencias de consenso introducidas mediante un enlace N- glicosídico.

6. El uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde dicha proteína es una exoproteína de P. aeruginosa.

7. El uso según la reivindicación 7, en donde dicha exoproteína de P. aeruginosa comprende dos de dichas secuencias de consenso introducidas.

8. El uso según la reivindicación 5, en donde dicho glicano comprende un oligosacárido o un polisacárido procedente de una bacteria Gram negativa.

9. El uso según la reivindicación 8, en donde dicho oligosacárido o polisacárido procede de Shigella spp, Pseudomonas spp o E. coli.

10. El uso según la reivindicación 9, en donde dicha Shigella spp es Shigella dysenteriae OI

11. El uso según la reivindicación 9, en donde dicha Pseudomonas spp es P. aeruginosa.

12. El uso según la reivindicación 11, en donde dicha P. aeruginosa es P. aeruginosa 011.

13. El uso según la reivindicación 5, en donde dicho glicano comprende un oligosacárido o un polisacárido procedente de una bacteria Gram negativa.

14. El uso según la reivindicación 1, en donde dicha proteína comprende al menos dos de dichas secuencias de consenso introducidas.

15. El uso según la reivindicación 14, en donde al menos uno de dichos glicanos es diferente de otro de dichos glicanos.

16. El uso según la reivindicación 1, en donde dicha proteína es CRM.

17. El uso según la reivindicación 1, en donde dicha proteína es la toxina colérica.