Producción potenciada de derivados de ácidos grasos.

Celula recombinante para su uso en la produccion de un alcohol graso que comprende (i) un gen que codifica para una acil-CoA sintasa (fadD),

(ii) un gen que codifica para una acil-CoA reductasa y (iii) un gen que codifica para una tioesterasa, en la que dichos genes estan sobreexpresados.

Producción potenciada de derivados de ácidos grasos

Campo técnico

Se proporcionan células y microorganismos modificados por ingeniería genética que producen productos a partir de la ruta de biosíntesis de ácidos grasos (es decir, derivados de ácidos grasos) , así como métodos para su uso. Los productos son particularmente útiles como biocombustibles.

Antecedentes Los desarrollos en la tecnología han ido acompañados de una dependencia aumentada de fuentes de combustibles. Tales fuentes de combustibles están pasando a ser cada vez más limitadas y difíciles de conseguir. Con la combustión de combustibles fósiles teniendo lugar a un ritmo sin precedentes, es probable que la demanda mundial de combustible sea pronto mayor que las existencias de combustible actuales.

Como resultado, se han dirigido esfuerzos para aprovechar fuentes de energía renovable, tales como luz solar, agua, viento y biomasa. El uso de biomasas para producir nuevas fuentes de combustible que no se derivan de fuentes de petróleo (es decir, biocombustible) ha aparecido como una opción alternativa. El biocombustible es un combustible de combustión limpia, biodegradable que puede estar compuesto por alcanos y ésteres. Un biocombustible a modo de ejemplo es biodiésel. El biodiésel puede usarse en la mayoría de los motores diésel de combustión interna o bien en forma pura, que se denomina biodiésel "no mezclado", o bien como mezcla en cualquier concentración con diésel de petróleo regular.

El biodiésel ofrece varias propiedades beneficiosas interesantes y atractivas en comparación con diésel a base de petróleo, incluyendo emisiones reducidas (por ejemplo, monóxido de carbono, azufre, hidrocarburos aromáticos, partículas de hollín, etc.) durante la combustión. El biodiésel también mantiene un ciclo de dióxido de carbono equilibrado debido a que está basado en materiales biológicos renovables. El biodiésel no es tóxico, es completamente biodegradable, y es muy seguro debido a su alto punto de ignición y baja inflamabilidad. Además, el biodiésel proporciona buenas propiedades de lubricación, reduciendo así el desgaste y la rotura de los motores.

Los métodos actuales de preparación de biodiésel implican transesterificación de triacilglicéridos a partir de materias primas de aceites vegetales, tal como colza en Europa, soja en América del Norte y aceite de palma en el Sureste Asiático. Por tanto, la producción de biodiésel a escala industrial está restringida geográfica y estacionalmente a zonas en las que se producen las materias primas de aceites vegetales. El procedimiento de transesterificación conduce a una mezcla de ésteres grasos que pueden usarse como biodiésel. Un subproducto no deseado del procedimiento de transesterificación es la glicerina. Para que puedan usarse como biodiésel, los ésteres grasos deben purificarse adicionalmente a partir del producto heterogéneo. Esto aumenta los costes y la cantidad de energía requerida para la producción de ésteres grasos y, en última instancia, también la producción de biodiésel. Además, las materias primas de aceites vegetales son fuentes de energía ineficaces debido a que requieren una superficie extensa para el cultivo. Por ejemplo, el rendimiento de biodiésel a partir de colza es de sólo 1300 l/hectárea debido a que sólo se usa el aceite de la semilla para la producción de biodiésel, y no el resto de la biomasa de la colza. Adicionalmente, el cultivo de algunas materias primas de aceites vegetales, tales como colza y soja, requiere rotación de cultivos frecuente para impedir el agotamiento de nutrientes de la tierra.

Zhang Hanxing et al., FEMS Microbiology Letters (2006) , vol. 259, n.º 2, páginas 249-253 dan a conocer la sobreexpresión de acil-CoA sintasa FadD en Escherichia coli.

Voelker TA et al., Journal of Bacteriology (1997) , vol. 176, n.º 23, páginas 7320-7327 dan a conocer la expresión de un ADNc de acil de cadena media-proteína portadora de acilo tioesterasa vegetal en Escherichia coli.

Por tanto, existe la necesidad de un biocombustible económica y energéticamente eficaz y un método de preparación de biocombustibles a partir de fuentes de energía renovable, tales como biomasa.

Sumario Esta invención se refiere a la producción de derivados de ácidos grasos a partir de células recombinantes. Generalmente, los derivados de ácidos grasos se producen mediante expresión o sobreexpresión de al menos un gen que codifica para una enzima de derivado de ácido graso. Además, un gen que codifica para una enzima acil-CoA deshidrogenasa puede modificarse en la célula recombinante de modo que la expresión del gen está atenuada.

Se proporciona una célula recombinante que comprende al menos uno de (a) al menos un gen que codifica para una enzima de derivado de ácido graso, gen que está modificado de modo que se sobreexpresa el gen, y (b) un gen que codifica para una enzima acil-CoA deshidrogenasa, gen que está modificado de modo que la expresión del gen está atenuada. El gen modificado que codifica para un gen de enzima de derivado de ácido graso puede ser un gen que codifica para una acil-CoA sintasa, una tioesterasa, una éster sintasa, una alcohol aciltransferasa, una alcohol deshidrogenasa, una acil-CoA reductasa, o una acil-CoA reductasa que forma alcohol graso. El gen modificado

puede codificar para una acil-CoA sintasa, una tioesterasa o una éster sintasa. La acil-CoA sintasa y una tioesterasa y/o una éster sintasa pueden modificarse. La célula también puede comprender un gen que codifica para una proteína transportadora.

La célula huésped o recombinante de la invención puede ser una célula de Saccharomyces cerevisiae, Candida lipolytica, E. coli, Arthrobacter, Rhodotorula glutinins, Acinetobacter, Candida lipolytica, Botr y ococcucs braunii, Vibrio furnissii, Micrococcus leuteus, Stenotrophomonas maltophilia o Bacillus subtilis, por ejemplo, una célula de Arthrobacter AK 19, Acinetobacter sp. cepa M-1, E. coli B, E. coli C, E. coli Ko E. coli W. En otras realizaciones, la célula recombinante es una célula cianobacteriana, por ejemplo, una célula de Synechocystis sp. PCC6803 o Synechococcus elongatus PCC7942. En todavía otras realizaciones, la célula recombinante es una célula vegetal, animal o humana. Alternativamente, la célula recombinante es una célula de microorganismo de una bacteria, levadura u hongo filamentoso.

Se proporciona una célula recombinante que puede producir un derivado de ácido graso, en la que la célula está modificada para incluir al menos una secuencia de ácido nucleico exógena que codifica para una enzima de derivado de ácido graso. La secuencia de ácido nucleico exógena puede codificar para una acil-CoA sintasa, una tioesterasa, una éster sintasa, una alcohol aciltransferasa, una alcohol deshidrogenasa, una acil-CoA reductasa o una acil-CoA reductasa que forma alcohol graso. La célula puede modificarse para incluir al menos dos secuencias de ácido nucleico exógenas que codifican para una enzima de derivado de ácido graso, por ejemplo, una primera secuencia de ácido nucleico exógena codifica para una acil-CoA sintasa y una segunda secuencia de ácido nucleico exógena codifica para una tioesterasa o una éster sintasa. El gen que codifica para una enzima de derivado de ácido graso puede modificarse para optimizar un codón para su expresión en la célula recombinante.

En una realización, la célula recombinante comprende un gen modificado que codifica para una acil-CoA sintasa, tal como fadD, fadk, BH3103, yhfL, Pfl-4354, EAV15023, fadD1, fadD2, RPC_4074, fadDD35, fadDD22, faa3p o el gen que codifica para la proteína ZP_01644857. Ejemplos de los genes de acil-CoA sintasa son fadDD35 de M. tuberculosis HR7Rv [NP_217021], yhfL de B. subtilis [NP_388908], fadD1 de P. aeruginosa PAO1 [NP_251989], el gen que codifica para la proteína ZP_01644857 de Stenotrophomonas maltophilia R551-3 o faa3p de Saccharomyces cerevisiae [NP_012257].

En una segunda realización, la célula recombinante comprende un gen modificado que codifica para una tioesterasa, tal como tesA, `tesA, tesB, fatB, fatB2, fatB3, fatB [M141T], fatA o fatA1.

En una tercera realización, la célula recombinante comprende un gen modificado que codifica para una éster sintasa, tal como un gen de éster sintasa obtenido de Acinetobacter spp., Alcanivorax borkumensis, Arabidopsis thaliana, Saccharomyces cerevisiae, Homo sapiens, Simmondsia chinensis, Mortierella alpina, Cr y ptococcus curvatus, Alcanivorax jadensis, Alcanivorax borkumensis. Acinetobacter sp. HO1-N o Rhodococcus opacus. Los ejemplos de genes de éster sintasa incluyen wax/dgat, una éster sintasa/acil-CoA:diacilglicerol aciltransferasa bifuncional de Simmondsia chinensis,... [Seguir leyendo]

1. Célula recombinante para su uso en la producción de un alcohol graso que comprende (i) un gen que codifica para una acil-CoA sintasa (fadD) , (ii) un gen que codifica para una acil-CoA reductasa y (iii) un gen que codifica para una tioesterasa, en la que dichos genes están sobreexpresados.

2. Célula recombinante según la reivindicación 1, en la que la célula comprende un gen que codifica para una proteína transportadora.

3. Célula recombinante según la reivindicación 1, en la que la célula es una célula de Saccharomyces cerevisiae, Candida lipolitica, Escherichia coli, Arthrobacter, Rhodotorula gluitinins, Acinetobacter, Candida lipolitica, Botr y ococcus braunii, Vibrio furnissii, Micrococcus leuteus, Stenotrophomonas maltophilia o Bacillus subtilis.

4. Célula recombinante según la reivindicación 1, en la que la célula es una célula cianobacteriana, preferiblemente una célula de Synechocystis sp. PCC6803 o Synechococcus elongatus PCC7942.

5. Célula recombinante según la reivindicación 1, en la que la célula es una célula vegetal, animal, humana, bacteriana, de levadura o de hongo filamentoso.

6. Célula recombinante según la reivindicación 3, en la que la célula es una célula de Arthrobacter AK 19, Acinetobacter sp. cepa M-1, E. coli B, E. coli C, E. coli Ko E. coli W.

7. Célula recombinante según la reivindicación 1, en la que el gen que codifica para una acil-CoA sintasa está modificado para estar optimizado para su expresión en la célula recombinante.

8. Célula recombinante según la reivindicación 1, que comprende además

(i) al menos uno de un gen pdh, panK, aceEF, fabH, fabD, fabG, acpP y fabF que está modificado para expresarse o sobreexpresarse;

(ii) al menos uno de un gen fadE, gpsA, IdhA, pflB, adhE, pta, poxB, ackA y ackB que está modificado de modo que la expresión del gen está atenuada; o (iii) al menos un gen modificado de plsB y sfa.

9. Método para producir alcoholes grasos en una célula recombinante que comprende

(i) obtener la célula recombinante según la reivindicación 1, 2 ó 3;

(ii) cultivar la célula recombinante en condiciones adecuadas para la expresión; y

(iii) producir alcoholes grasos.