Polipéptidos híbridos con propiedades seleccionables.

Un polipéptido híbrido que presenta al menos dos actividades hormonales,

comprendiendo dicho polipéptido un primer módulo hormonal peptídico bioactivo ligado por enlace covalente a al menos un módulo hormonal peptídico bioactivo adicional, en el que:

la primera hormona peptídica bioactiva es exendina-4 o un análogo de la misma que tiene una identidad de secuencia de al menos 50 % con la exendina-4 (SEC ID Nº:66);

el al menos un módulo hormonal peptídico bioactivo adicional es amilina, un análogo de la misma que tiene una identidad de secuencia de al menos 50 % con la amilina (SEC ID Nº:45), o hAmilina(1-7)-11,18 Arg-sCT(8- 27)- Amilina(33-37) (SEC ID Nº:396);

los módulos hormonales peptídicos bioactivos están unidos por enlace covalente usando un enlazador de glicina; la primera hormona peptídica bioactiva es un agonista del receptor de GLP-1 y presenta la actividad de secreción de insulina de la exendina-4; y

la al menos una hormona peptídica bioactiva adicional presenta la actividad de reducción de ingesta de alimento de la amilina.

Polipéptidos híbridos con propiedades seleccionables

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención está relacionada con química de péptidos y más particularmente con polipéptidos híbridos con propiedades seleccionables.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La regulación de los niveles de insulina y glucemia es primordial para muchas enfermedades y trastornos metabólicos. La secreción de insulina está modulada en parte por hormonas secretagogas, denominadas incretinas, producidas por células enteroendocrinas. La hormona incretina, péptido 1 similar a glucagón (“GLP-1”) , es una hormona peptídica secretada por células intestinales que, en múltiples estudios, se ha demostrado que produce un efecto potenciador sobre la secreción de insulina. El GLP-1 se procesa a partir de proglucagón en el intestino y potencia la liberación de insulina inducida por nutrientes (Krcymann B., et al., Lancet, 2: 1300-1303 (1987) ) . Se sabe que diversas formas truncadas de GLP-1 estimulan la secreción de insulina (acción insulinotrópica) y la formación de AMPc [véase, por ejemplo, Mojsov, S., Int. J. Pep. Pro. Res., 40: 333-343 (1992) ]. Se ha establecido una relación entre los diversos experimentos de laboratorio realizados in vitro y las respuestas insulinotrópicas en mamíferos, especialmente en seres humanos, con la administración exógena de GLP-1, GLP-1 (7-36) amida (SEC ID Nº: 61) y GLP-1 (7-37) ácido (SEC ID Nº: 204) (véase, por ejemplo, Nauck, M. A., et al., Diabetologia, 36: 741-744 (1993) ; Gutniak, M., et al., New Eng. J. of Med., 326 (20) : 1316-1322 (1992) ; Nauck, M. A., et al., J. Clin. Invest., 91: 301-307 (1993) ; y Thorens, B., et al., Diabetes, 42: 1219-1225 (1993) ) .

El GLP-1 (7-36) amida (SEC ID Nº: 61) ejerce un efecto antidiabetogénico pronunciado en diabéticos insulinodependientes estimulando la sensibilidad a la insulina y potenciando la liberación de insulina inducida por glucosa a concentraciones fisiológicas (Gutniak M., et al., New Eng. J. Med., 326: 1316-1322 (1992) ) . Cuando se administra a diabéticos no insulinodependientes, el GLP-1 (7-36) amida (SEC ID Nº: 61) estimula la liberación de insulina, disminuye la secreción de glucagón, inhibe el vaciado gástrico y potencia la utilización de la glucosa (Nauck, 1993; Gutniak, 1992; Nauck, 1993) . Sin embargo, el uso de moléculas de tipo GLP-1 durante una terapia de diabetes prolongada se ha complicado dado que la semivida en suero de dichos péptidos es bastante corta.

Más particularmente, el GLP-1 es un péptido de 30 aminoácidos derivado del proglucagón, una prohormona de 160 aminoácidos. Las acciones de diferentes convertasas prohormonales en el páncreas y en el intestino dan como resultado la producción de glucagón y de otros péptidos mal definidos, mientras que la escisión del proglucagón da como resultado la producción de GLP-1 y GLP-2 así como de otros dos péptidos. La secuencia de aminoácidos de GLP-1 es 100 % homóloga en todos los mamíferos hasta ahora estudiados, lo que implica un papel fisiológico crítico. El GLP-1 (7-37) ácido está truncado y amidado en el extremo C para formar GLP-1 (7-36) NH2 (SEC ID Nº: 61) . Los efectos biológicos y la renovación metabólica del GLP-1 (7-37) OH libre de ácido (SEC ID Nº: 204) , y la amida, GLP-1 (7-36) NH2 (SEC ID Nº: 61) , son indistinguibles. Por convención, la numeración de los aminoácidos se basa en el GLP-1 (1-37) OH (SEC ID Nº: 59) procesado a partir del proglucagón. El GLP-1 biológicamente activo es el resultado de un procesamiento adicional: GLP-1 (7-36) NH2 (SEC ID Nº: 61) . Por tanto, el primer aminoácido de GLP-1 (7-37) OH (SEC ID Nº: 204) o GLP-1 (7-36) NH2 (SEC ID Nº: 61) es 7His.

En el tracto gastrointestinal, el GLP-1 lo producen las células L de la mucosa intestinal, colónica y rectal, en respuesta a la estimulación por la glucosa intraluminal. La semivida en plasma del GLP-1 activo es < 5 minutos y su tasa de eliminación metabólica es de aproximadamente 12-13 minutos (Holst, Gastroenterology 107 (6) : 1848-55 (1994) ) . La principal proteasa implicada en el metabolismo del GLP-1 es la dipeptidil peptidasa (DPP) IV (CD26) que escinde el dipéptido His-Ala N terminal, produciendo de este modo metabolitos, GLP-1 (9-37) OH (SEC ID Nº: 205) o GLP-1 (9-36) NH2 (SEC ID Nº: 206) que se describen de diversos modos como antagonistas o agonistas inactivos, débiles, del receptor de GLP-1. El receptor de GLP-1 (GLP-1R) es un receptor acoplado a la proteína G de 463 aminoácidos y se localiza en las células beta pancreáticas, en los pulmones, y a un menor grado en el cerebro, tejido adiposo y riñones. La estimulación de GLP-1R por GLP-1 (7-37) OH (SEC ID Nº: 204) o GLP-1 (7-36) NH2 (SEC ID Nº: 61) da como resultado la activación de la adenilato ciclasa, la síntesis de AMPc, la despolarización de la membrana, el aumento del calcio intracelular y el aumento de la secreción de insulina inducida por glucosa (Holz et al., J. Biol. Chem. 270 (30) : 17749-57 (1995) ) .

El GLP-1 es un fuerte secretagogo de insulina que se secreta a partir de la mucosa intestinal en respuesta a la ingesta de alimento. El efecto profundo de la incretina de GLP-1 está acentuado por el hecho de que ratones GLP1R genosuprimidos (knockout) son intolerantes a la glucosa. La respuesta de la incretina del GLP-1 infundido i.v. se preserva en sujetos diabéticos, aunque la respuesta de la incretina a la glucosa oral en estos pacientes está comprometida. La administración de GLP-1 por infusión o por inyecciones s.c. controla los niveles de la glucosa en ayunas en los pacientes diabéticos y mantiene el umbral de glucosa para la secreción de la insulina (Gutniak et al.,

N. Engl. J. Med. 326: 1316-22 (1992) ; Nauck et al., Diabet. Med. 13: (9 Suppl 5) :S39-S43 (1996) ; Nauck et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 76: 912-917 (1993) ) . El GLP-1 ha mostrado un tremendo potencial como un agente terapéutico

capaz de aumentar la secreción de insulina de una manera fisiológica, al mismo tiempo que evita la hipoglucemia asociada con fármacos de sulfonilurea.

Otros efectos importantes del GLP-1 sobre la homeostasis de la glucosa son la supresión de la secreción de glucagón y la inhibición de la motilidad gástrica. Las acciones inhibidoras del GLP-1 sobre la selección de células alfa pancreáticas de glucagón conducen a disminuir la producción de glucosa hepática mediante la reducción de la gluconeogénesis y la glucogenolisis. Este efecto antiglucagón del GLP-1 está preservado en pacientes diabéticos.

El efecto denominado freno ileal del GLP-1, en el que tanto la motilidad como la secreción gástrica están inhibidas, se efectúa mediante receptores eferentes vagales o por acción directa sobre el músculo liso intestinal. La reducción de la secreción de ácido gástrico por GLP-1 contribuye a una fase de latencia en la disponibilidad de nutrientes, obviando por tanto la necesidad de una respuesta rápida a la insulina. En resumen, los efectos gastrointestinales del GLP-1 contribuyen significativamente a retrasar la absorción de glucosa y ácidos grasos y a modular la secreción de insulina y la homeostasis de la glucosa.

También se ha observado que el GLP-1 induce genes específicos de células beta, tales como el transportador de GLUT-1, insulina (mediante la interacción de PDX-1 con el promotor del gen de insulina) y hexoquinasa-1. Por tanto, el GLP-1 invertiría potencialmente la intolerancia a la glucosa normalmente asociada con el envejecimiento, como lo demuestran experimentos realizados con roedores. Además, el GLP-1 puede contribuir a la neogénesis de células beta y a aumentar la masa de células beta, además de reestablecer la función de las células beta durante estados de insuficiencia de células beta.

Los efectos fundamentales del GLP-1 incluyen aumentos en la saciedad junto con disminuciones en la ingesta de alimento, efectuado mediante la acción del GLP-1R hipotalámico. Una infusión SC continua durante 48 horas de GLP-1 en sujetos con diabetes de tipo II, disminuye el apetito y la ingesta de alimento y aumenta la saciedad. Estos efectos anoréxicos están ausentes en ratones GLP-1R genosuprimidos (knockout) .

Las exendinas son otra familia de péptidos implicada en la secreción de insulina. Las exendinas se encuentran en la saliva del monstruo de Gila, un lagarto endógeno de Arizona, y del Lagarto Moteado Mexicano. La exendina-3 está presente en la saliva de Heloderma horridum, y la exendina-4 está presente en la saliva de Heloderma suspectum (Eng, J., et al., J. Biol. Chem., 265: 20259-62, 1990; Eng., J., et al., J. Biol. Chem., 267: 7402-05 (1992) ) . Las exendinas tienen cierta similitud de secuencia con diversos miembros de la familia de péptidos similares a glucagón,... [Seguir leyendo]

1. Un polipéptido híbrido que presenta al menos dos actividades hormonales, comprendiendo dicho polipéptido un primer módulo hormonal peptídico bioactivo ligado por enlace covalente a al menos un módulo hormonal peptídico bioactivo adicional, en el que:

la primera hormona peptídica bioactiva es exendina-4 o un análogo de la misma que tiene una identidad de secuencia de al menos 50 % con la exendina-4 (SEC ID Nº:66) ; el al menos un módulo hormonal peptídico bioactivo adicional es amilina, un análogo de la misma que tiene una identidad de secuencia de al menos 50 % con la amilina (SEC ID Nº:45) , o hAmilina (1-7) -11, 18Arg-sCT (8-27) Amilina (33-37) (SEC ID Nº:396) ; los módulos hormonales peptídicos bioactivos están unidos por enlace covalente usando un enlazador de glicina; la primera hormona peptídica bioactiva es un agonista del receptor de GLP-1 y presenta la actividad de secreción de insulina de la exendina-4; y la al menos una hormona peptídica bioactiva adicional presenta la actividad de reducción de ingesta de alimento de la amilina.

2. El polipéptido híbrido de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la al menos una hormona peptídica bioactiva adicional se une al receptor de amilina.

3. El polipéptido híbrido de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la al menos una hormona peptídica bioactiva adicional tiene una identidad de secuencia de al menos 50 % con la hAmilina (1-7) -11, 18Arg-sCT (8-27) -Amilina (33-37) y es un agonista del receptor de calcitonina (CTR) .

4. El polipéptido híbrido de la reivindicación 1, en el que el al menos un módulo hormonal peptídico bioactivo adicional se selecciona del grupo que consiste en: hAmilina (1-7) -11, 18Arg-sCT (8-27) -Amilina (33-37) y 25, 28, 29Pro-h-Amilina.

5. El polipéptido híbrido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en el que el primer péptido bioactivo está ligado por su extremo C al extremo N del al menos un péptido bioactivo adicional.

6. El polipéptido híbrido de la reivindicación 5, en el que el enlazador de glicina tiene una longitud de 1 a 30 restos.

7. El polipéptido híbrido de la reivindicación 6, en el que el enlazador tiene una longitud de 3 a 30 restos.

8. El polipéptido híbrido de la reivindicación 7, en el que el enlazador comprende Gly-Gly-Gly.

9. El polipéptido híbrido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el extremo C-terminal del polipéptido híbrido está amidado.

10. El polipéptido híbrido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el análogo de exendina tiene una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos 80 % con la exendina 4.

11. El polipéptido híbrido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que el análogo de exendina tiene una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos 90 % con la exendina-4.

12. El polipéptido híbrido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 en el que el análogo de amilina tiene una identidad de secuencia de aminoácidos de al menos 80 % con la amilina.

13. Una composición farmacéutica que comprende el polipéptido híbrido de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10.

14. La composición farmacéutica de la reivindicación 13, para su uso en el tratamiento de la diabetes.

15. La composición farmacéutica para el uso de la reivindicación 14 en la que la diabetes es diabetes de tipo II.