Planta genéticamente modificada capaz de biosintetizar capsinoides.

Un método para producir una planta genéticamente modificada que tiene una capacidad de producción de capsinoides aumentada,

que comprende llevar a cabo una modificación genética para disminuir la expresión o actividad de una enzima que cataliza una reacción de conversión de grupos amino de vainillina a vainillilamina en una planta que tiene un sistema para la biosíntesis de capsaicinoide, en donde la planta pertenece al género Capsicum y en donde la enzima es un producto del gen pAMT.

Planta genéticamente modificada capaz de biosintetizar capsinoides Campo técnico La presente invención se refiere a un método para producir una planta genéticamente modificada que biosintetiza una cantidad aumentada de capsinoides, y a un método de producción de capsinoides a partir de la planta genéticamente modificada.

Antecedentes de la técnica El capsaicinoide (capsaicina, dihidrocapsaicina, etc.) , que es un componente picante del pimiento, es eficaz para prevenir la obesidad ya que promueve el metabolismo energético, estimula nervios centrales para promover la secreción de hormonas y activa la enzima lipolítica. Además, esteriliza el tracto gastrointestinal y mejora la inmunidad y es también eficaz para activar la inmunidad y mitigar la fatiga. Sin embargo, puesto que el capsaicinoide irrita la mucosa, su ingestión en grandes cantidades puede alterar el estado gastrointestinal. Además, a muchos japoneses no les gustan los sabores picantes.

Se ha comunicado que un pimiento menos picante, "CH-19 Sweet" (Registro de Variedad nº 10375) , que es una variedad fijada y no picante de pimiento seleccionada y fijada por Yazawa et al., contiene una gran cantidad de nuevos capsinoides (por ejemplo, documento 1 de no patente) . Dichos compuestos, que pertenecen a los capsinoides (éster de alcohol vainíllico y ácido graso, capsiato, dihidrocapsiato, etc., a los que más adelante se hace a veces simplemente referencia como "capsinoide" o "capsinoides") , son diferentes del capsaicinoide y no tienen un sabor picante. Sin embargo, se ha comunicado que muestran una acción potenciadora de la inmunidad, una acción activadora del metabolismo energético, una acción promotora del consumo de oxígeno, y similares (por ejemplo, documentos 1 y 2 de patente y documento 2 de no patente) , y de ellos se espera que sean materiales de partida para suplementos y similares en el futuro.

En la mayoría de los pimientos, se forma vainillilamina a partir de fenilalanina a través de ácido ferúlico, vainillina y similares, y se produce capsaicinoide a partir de vainillilamina y un ácido graso de cadena ramificada mediante la capsaicinoide sintasa [Figura 1 (a) ]. Por contraste, apenas se produce capsaicinoide en CH-19 Sweet y en vez de él se produce capsinoide. Sin embargo, la razón de esto se ha desconocido durante años.

Como se mencionó anteriormente, los capsinoides tienen un sabor poco picante pero muestran actividades fisiológicas superiores similares a las del capsaicinoide. Por lo tanto, se espera su futura aplicación como material de partida para suplementos y similares. Por lo tanto, se desea clarificar la ruta biosintética de los capsinoides con el propósito de cultivar y desarrollar nuevas variedades vegetales capaces de producir capsinoides.

Referencias de la técnica previa Documentos de patente:

Documento 1 de patente: JP-A-11-246478.

Documento 2 de patente: JP-A-2001-026538.

Documentos de no patente:

Documento 1 de no patente: Yazawa et al., Journal of the Japanese Society for Horticultural Science, volumen 58, páginas 601-607, 1989.

Documento 2 de no patente: Biosci. Biotech. Biochem., 65 (12) , 2735-2740 (2001) .

Sumario de la invención Problemas a resolver por la invención Por lo tanto, un objeto de la presente invención es clarificar la ruta biosintética de los capsinoides y, basándose en el hallazgo, obtener una planta capaz de producir capsinoides mediante la modificación genética de una planta distinta a la CH-19 Sweet actualmente conocida para producir capsinoides.

Medios para resolver los problemas Los presentes inventores han llevado a cabo estudios intensivos para alcanzar el objeto anteriormente mencionado y han hallado que, en CH-19 Sweet, el gen pAMT que codifica la aminotransferasa que cataliza una reacción de conversión de grupos amino de vainillina a vainillilamina contiene una mutación por inserción. Es decir, se ha clarificado en cuanto a CH-19 Sweet que se produce un codón de parada a causa de una mutación por inserción de una base en la región de codificación del gen pAMT de la variedad picante "CH-19 Hot", que es una variedad

parental de la misma, y no se produce una aminotransferasa funcional. Los presentes inventores formularon la hipótesis de que, como resultado de la mutación del gen pAMT, en CH-19 Sweet se hace dominante una reacción de reducción de vainillina a alcohol vainíllico en lugar de la conversión de grupos amino de vainillina a vainillilamina, y que otra reacción de esterificación con un ácido graso de cadena ramificada da lugar a la producción de capsinoides [Figura 1 (b) ].

Para verificar la hipótesis, los presentes inventores han preparado plantas transgénicas que tienen un ácido nucleico antisentido de pAMT introducido en una variedad picante, la variedad "Takanotsume" de Capsicum annuum. Se ha hallado que disminuye la producción de capsaicinoide pero aumenta notablemente la producción de capsinoide en una estirpe que muestra una expresión notablemente disminuida del gen pAMT entre las plantas transgénicas obtenidas.

Los presentes inventores han llevado a cabo más estudios basados en estos hallazgos y han completado la presente invención.

En consecuencia, la presente invención proporciona lo siguiente:

[1] Un método para producir una planta genéticamente modificada que tiene una capacidad de producción de capsinoides aumentada, que comprende llevar a cabo una modificación genética para disminuir la expresión o actividad de una enzima que cataliza una reacción de conversión de grupos amino de vainillina a vainillilamina en una planta que tiene un sistema para la biosíntesis de capsaicinoide, en donde la planta pertenece al género Capsicum y en donde la enzima es un producto del gen pAMT.

[2] El método según el punto [1] anterior, que comprende además seleccionar una planta que muestra una cantidad aumentada de producción de capsinoides en comparación con una planta no genéticamente modificada.

[3] El método según el punto [1] o [2] anterior, en donde la modificación genética es seleccionada del grupo que consiste en una introducción de un DNA que codifica un RNA antisentido, un iRNA, una ribozima o un mutante dominante-negativo para el susodicho gen enzimático, una destrucción del gen mediante un método de inactivación génica o un tratamiento con mutágenos, y una introducción de un gen que codifica un anticuerpo contra la enzima.

[4] Un método para producir capsinoide, que comprende recuperar el capsinoide de un fruto de una planta genéticamente modificada y distinta de CH-19 Sweet, que muestra una expresión o actividad disminuida de una enzima que cataliza una reacción de conversión de grupos amino de vainillina a vainillilamina y una capacidad de producción de capsinoides aumentada, en comparación con poblaciones silvestres, en donde la planta pertenece al género Capsicum y la enzima es un producto del gen pAMT.

[5] El método según el punto [4] anterior, en donde la susodicha expresión o actividad disminuida de la enzima es causada por una destrucción o mutación del gen enzimático, una descomposición o una traducción suprimida de un producto de transcripción del gen, o una inhibición de la acción de la enzima sobre la vainillina.

Efecto de la invención La presente invención también permite aumentar la producción de capsinoides en una variedad vegetal que no produce sustancialmente capsinoides o sólo produce una pequeña cantidad de los mismos.

Breve descripción de los dibujos La Figura 1 muestra las esperadas rutas de síntesis de la capsaicina (a) y el capsiato (b) .

La Figura 2 es un diagrama esquemático de un vector plasmídico Ti, pIG121-Hm, que tiene un gen pAMT insertado en la dirección antisentido.

La Figura 3 muestra los resultados de una PCR genómica usando DNA extraído de trozo (s) de hoja de pimiento transformado como un molde, en donde M es un marcador, C (del inglés, control) es un testigo (variedad "Takanotsume" de Capsicum annuum sin modificación genética) , y cada número representa individuos seleccionados del pimiento transformado.

La Figura 4 muestra los resultados analíticos del contenido de capsiato (a) y el contenido de capsaicina (b) de frutos de pimiento transformado y CH-19 Sweet y la variedad "Takanotsume" de Capsicum annuum.

La Figura 5 muestra los resultados analíticos de la expresión de la transcripción del gen pAMT en frutos de pimiento transformado y la variedad "Takanotsume" de Capsicum annuum.

La Figura 6 muestra los resultados analíticos de proteínas extraídas de frutos de pimiento transformado, mediante análisis por transferencia Western, en donde cada carril es 1: CH-19 Hot, 2:... [Seguir leyendo]

1. Un método para producir una planta genéticamente modificada que tiene una capacidad de producción de capsinoides aumentada, que comprende llevar a cabo una modificación genética para disminuir la expresión o actividad de una enzima que cataliza una reacción de conversión de grupos amino de vainillina a vainillilamina en una planta que tiene un sistema para la biosíntesis de capsaicinoide, en donde la planta pertenece al género Capsicum y en donde la enzima es un producto del gen pAMT.

2. El método según la Reivindicación 1, que comprende además seleccionar una planta que muestra una cantidad aumentada de producción de capsinoides en comparación con una planta no genéticamente modificada.

3. El método según la Reivindicación 1 o 2, en donde la modificación genética es seleccionada del grupo que

consiste en una introducción de un DNA que codifica un RNA antisentido, un iRNA, una ribozima o un mutante dominante-negativo para el susodicho gen enzimático, una destrucción del gen mediante un método de inactivación génica o un tratamiento con mutágenos, y una introducción de un gen que codifica un anticuerpo contra la enzima.

4. Un método para producir capsinoide, que comprende recuperar el capsinoide de un fruto de una planta genéticamente modificada y distinta de CH-19 Sweet, que muestra una expresión o actividad disminuida de una enzima que cataliza una reacción de conversión de grupos amino de vainillina a vainillilamina y una capacidad de producción de capsinoides aumentada, en comparación con poblaciones silvestres, en donde la planta pertenece al género Capsicum y la enzima es un producto del gen pAMT.

5. El método según la Reivindicación 4, en donde la susodicha expresión o actividad disminuida de la enzima es causada por una destrucción o mutación del gen enzimático, una descomposición o una traducción suprimida de un 20 producto de transcripción del gen, o una inhibición de la acción de la enzima sobre la vainillina.